1、2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,第10章 基因工程基礎,第一節(jié) 基因工程概述 第二節(jié) 目的基因的獲得 第三節(jié) 分子克隆中常用的載體 第四節(jié) 分子克隆中常用的工具酶 第五節(jié) 目的基因和載體連接、轉化、篩選 第六節(jié) 基因工程和醫(yī)藥,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,DNA克隆 克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷 貝的集合. 獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning), 即無性繁殖. 技術水平: DNA克隆:分子克隆

2、(molecular clone) 細胞克隆 個體克隆(動物或植物),第一節(jié) 基因工程概述,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,DNA克隆: 應用酶學的方法,在體外將各種來源的DNA(同 源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的)與載 體DNA接合成一具有自我復制能力的分子 復制子(replicon),繼而通過轉化或轉染宿主 細胞,篩選出含有目的基因的轉化子,再進行 擴增提取獲得大量同一DNA分子,也稱基因克 隆或重組DNA(recombinant DNA).,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 Sc

3、hool Pharmacy of Yantai University,生物技術工程:基因工程、蛋白質工程、 酶工程、細胞工程等,基因工程(genetic engineering) :實現基因克隆所用的方法及相關的工作,又稱重組DNA工藝學. 目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產物(蛋白質),2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,第二節(jié) 目的基因的獲得,一 目的基因的獲得:

4、化學合成 聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增 建立基因組DNA文庫 構建cDNA文庫,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,化學合成法: 要求:1)已知目的基因的序列或其產物 的氨基酸序列 2)片段不宜太長 工具:自動化DNA合成儀 應用:1)合成PCR引物 2)寡核苷酸探針 3)人工接頭序列及較小的基因,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,* 化學合成法獲取目的基因,由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列,2020年8月6日2時6分,煙

5、臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增,1985年美國科學家Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術 PCR是應用最廣的分子生物學技術之一,可用來快速在體外擴增DNA, PCR技術在臨床檢驗和分子生物學中的應用十分廣泛. PCR技術就是在體外的離心管中通過酶促反應有選擇地大量擴增(包括分離)一段目的基因的技術,即體外進行DNA復制.,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,需要的

6、物質:模板DNA,引物,dNTP(Mg2+),TaqDNA聚合酶 4種反應混合物經歷變性、退火、延伸三步 94,熱變性,雙鏈解開 55,冷卻退火,引物與模板的單鏈DNA 的特定互補部位相配對和結合 72,TaqDNA聚合酶作用下,新鏈延伸, 形成互補DNA雙鏈 如此30個循環(huán)可獲得230個基因片段,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,聚合酶鏈反應原理,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,Taq DNA聚合酶(Taq DNA pol,

7、Taq pol) 1969年在美國黃石公園溫泉分離出一種嗜熱真 菌,cetus公司首次分離純化了該酶,分子量 94KD,該酶特點: 最適反應溫度是75-80,能抵抗鏈分離所 需要的高溫(94-95)的反復處理.,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,建立基因組DNA文庫,基因組DNA

8、文庫: 分離供體細胞中的染色體DNA,酶切后,將這些染色體 DNA片段與某種載體相接,而后轉入大腸桿菌,建立包 含有供體染色體DNA片段的克隆株, 特點:克隆株群體提供全套遺傳信息,即完整的基因 組DNA,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,構建基因組文庫過程: 分離純化基因組DNA 制備全部基因組的DNA片段 機械斷裂法(超聲波或高速攪拌) 斷裂片段兩端沒有與克隆載體匹配的粘末端, 因此插入載體

9、之前還需要進行修飾加工,少用 限制性內切酶降解(鳥槍法)(常用Sau3A) 斷裂片段兩端有與克隆載體匹配的粘末端, 可以直接與處理過的載體連接 DNA片斷與載體的連接 常用載體:噬菌體 轉化細菌 1個克隆含有基因組的某個片段,整個克隆群體就包 含基因組的全部基因片段總和.,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,構建cDNA文庫,cDNA文庫:以mRNA為模板在反轉錄酶的作用下將形 成的互補DNA(c

10、DNA)建立基因文庫. 特點: 無內含子,長度比基因組基因小,操作簡單 mRNA比基因組中基因少,篩選基因工作量小 mRNA中拷貝數大于基因組中的拷貝數, 利于獲得較多的模板. 可在原核細胞中表達有生物活性蛋白 不同種類不同狀態(tài)的細胞的cDNA文庫不同 不能研究基因組的結構功能,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,構建cDNA文庫過程: 1)制備mRNA. 先提取總RNA,再分離 mRNA.通過oligo(dT) 纖維素分離mRNA,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of

11、 Yantai University,2)第一股 cDNA合成 以Oligo(dT)為引物:從模板 3末端開始,沿模板35方 向合成 隨機引物:以68個核苷酸 為隨機引物,從mRNA的不同 結合點合成全長cDNA第一鏈 3)第二股cDNA的合成 自身引導法 外加引物合成法,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,4)cDNA與載體連接和導入宿主細胞,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 Scho

12、ol Pharmacy of Yantai University,第三節(jié) 分子克隆中常用的載體,載體：為攜帶目的基因,實現其無性繁殖或表達所采用的一些DNA分子. 基本特征: 能自我復制、有多克隆位點、有選擇標記 常用載體有3大類: 1.質粒 2.噬菌體 3.病毒,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,根據使用目的分為： 克隆載體：使插入的外源DNA序列擴增 表達載體：使插入的外源DNA序列轉錄翻譯成多肽鏈,理想的質粒載體,應具備以下幾個條件 (1)能自主復制,即本身是復制子 (2)具有一種或多種限制酶的單一切割位

13、點,并在此位點中插入外源基因片段,不影響本身的復制功能 (3)在基因組中有1-2個篩選標記,為寄主細胞提供易于檢測的表型特征, (4)分子量要小,多拷貝,易于操作.,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,一 質粒載體,1.質粒的基本特性 本質是細菌染色體以外的遺傳物質,是一種簡單的,能自主復制的環(huán)狀DNA分子. 命名:前一個小寫p代表質粒,后兩個大寫英文字母代表發(fā)現者或實驗室,數字代表編號,如pBR322,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai Univers

14、ity,質粒的復制類型: 嚴緊型:低拷貝 1-3個拷貝/菌 松弛型:高拷貝 10-60個拷貝/菌 不相容性:在同一細胞中,同類質粒不能并存的現象.pUC18 pUC19 分配功能:質粒復制后,隨細胞分裂的進行,質粒分配到子細胞中,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2.質粒的分離純化方法,氯化銫-溴乙錠密度梯度超速離心分離法 Triton和PEG化學提取法 煮沸裂解菌體,異丙醇沉淀質粒DNA 堿變性法抽提質粒DNA 試劑盒法,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yan

15、tai University,1、接大腸桿菌于4ml LB培養(yǎng)基2、37振蕩培養(yǎng)過夜3、取1.5ml菌液于Ep管,5000rpm離心3min,棄上清4、加0.lml溶液I(1葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0, 25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1 SDS),輕輕翻轉混勻,置于冰浴5 min6、加入0.15m1預冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),輕輕翻轉混勻,置于冰浴5 min7、10000rpm離心15min,取上清液于另一新Ep管8、加入等體積的異戊醇,混勻后于靜置10min9、再以100

16、00rpm離心5min,棄上清10、用70乙醇0.5ml洗滌一次,抽干所有液體11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE緩沖液中,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,3.大腸桿菌質粒載體,1) pSC101質粒載體 第一個克隆真核基 因的載體(非洲爪蟾卵母細胞rDNA),2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,Ampr,ORI,Tetr,2)pBR322質粒:一種克隆質粒,ORI:復制起始點, 保證高拷貝自我復制.,結構:,Ampr, T

17、etr:,兩個抗性基因用于 篩選陽性克隆.,Pst I, BamH I:,兩個單酶切位點用于插入目的基因,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,3)多功能質粒-pUC質粒,pUC質粒由pBR322改建成的,帶有LacZ基因.LacZ上 有多克隆位點,插入外源基因后在X-gal平板上使原 先的藍斑變成白斑.,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,4)pET系統(Novagen公司),2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School

18、 Pharmacy of Yantai University,5.酵母表達常用載體,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,6.哺乳動物細胞常用表達載體,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,腺病毒載體系統,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,BACK,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai Unive

19、rsity,常用的工具酶（tool enzymes）有： 1.限制性核酸內切酶（resriction enzymes,restriction endonadease) 2.DNA連接酶（DNA ligase) 3.逆轉錄酶(reverse transcriptase) 6.末端轉移酶(terminal transferase) 以1.和2.最為常用.工具酶現已商品化,第四節(jié) 分子克隆中常用的工具酶,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,一 限制性核酸內切酶 定義:一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列,并

20、由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶. 限制性內切酶的發(fā)現 Luria和Human發(fā)現細菌能將外來的DNA片段在某些專一位點上切斷,從而保證其不被外來噬菌體所感染,而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾(甲基化)而得以保護,這種現象叫做限制修飾.,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,第一個字母取自產生該酶的細菌屬名,用大寫； 第二、第三個字母是該細菌的種名,用小寫； 第四個字母代表株； 用羅馬數字表示發(fā)現的先后次序.,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌d株的第三種酶

21、,Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到第一個限制性內切核酸酶Hind I,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,分類: 型:識別和切割位點不固定,隨機 型:核酸內切酶活性和甲基化活性不分開 型:能特異在識別位點處切割DNA.核酸內 切酶活性和甲基化活性是分開的.最常用！,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,型限制性核酸內切酶基本特性: 特異的識別48個核苷酸組成的識別序列, 識別序列呈回文結構:兩個順序相同的拷貝在 DNA鏈

22、上呈反向排列 5 -G AATTC-3 3 -CTTAA G-5 ,EcoR,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,1.產生5突出粘性末端(sticky end),EcoR I,經限制酶切割后的位點,DNA斷裂類型:,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2.產生3突出粘性末端,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院

23、 School Pharmacy of Yantai University,3.產生平末端(blunt end),Alu I,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,影響限制性內切酶活性的因素,DNA的純度,增加酶量、擴大體積、延長時間 DNA的甲基化,選用失去甲基化功能的菌株 溫度,一般37,還有25.30.60等 分子結構,超螺旋,線性,識別序列兩側 限制酶的緩沖液,Mg2+,Tris-Cl,DTT,BSA, NaCl,KCl等 星號活性(star activity) EcoR切 GAATTC EcoR*切 pu

24、puATpypy 或AATT,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,限制性內切酶用途:,基因重組過程中切割DNA以獲取目的基 因片段,切割載體形成切口,使目的基因能插入載體中.,2.限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphysms, RFLP)分析:遺傳病的診斷,法醫(yī) DNA指紋分析等.,3.構建DNA的物理圖譜,基因定位,DNA的 同源性分析等等.,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai Univers

25、ity,二 DNA連接酶,DNA連接酶(Ligase)是一種能夠催化在雙鏈DNA鏈的3-OH和5-P之間形成磷酸二酯鍵的酶,可連接互補粘性末端或平端以及缺口修復,不能連接單鏈DNA或裂口 常用的是T4 DNA連接酶：來源噬菌體T4感染Ecoli,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,三 逆轉錄酶 以RNA為模板,逆轉錄成cDNA第一鏈,又稱依賴 RNA的DNA聚合酶.(AMV最常用) 聚合酶活性:RNA或DNA為模板 3外切酶活性:能降解DNA-RNA雜合鏈中的RNA 應用: 1.RT-PCR 使mRNA逆轉錄成c

26、DNA 2.制備探針 商品化逆轉錄酶有兩種： AMV(禽成髓細胞瘤) Mc-MLV(鼠白血病病毒).,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,四 末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal transferase,TTE) 可催化DNA片段上3-OH端加接脫氧核糖核苷酸 (不需模板,但底物至少要3個bp,需Mg2+) 常用于同種堿基多聚體接尾反應 核素標記DNA片段的3端,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,第五節(jié) 目的基因和載體連接、轉化

27、、篩選,一 外源基因與載體的連接 粘性末端連接 方式:(1)同一限制酶切位點連接 (2)不同限制酶切位點連接,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,Bam H切割反應,T4 DNA連接酶 15C,同一限制酶切位點連接,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,不同限制酶切位點的連接,Eco R切割位點,Bg l切割位點,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2.

28、平端連接 限制性內切酶切割產生的平端，直接連接效率低,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,導入大腸桿菌 1.原生質體轉化法 2.氯化鈣轉化法 3.電擊法,導入哺乳動物細胞 1. 顯微注射法 2. 電穿孔法 3. DNA-磷酸鈣共沉淀 4. DEAE-葡聚糖轉染法 5. 病毒感染法 6. 脂質體介導法 7. 細胞融合法 8. 原生質體融合法,二 重組DNA導入受體菌,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,轉化就是以質粒作為克隆載體將目的

29、基因導入宿主細胞(感受態(tài))的過程. 感受態(tài)細胞是指細胞處于容易接受外源DNA的狀態(tài).常用CaCl2法制備,過程: 接種細菌振蕩過夜以約1:100的接種量接入新的20ml LB中培養(yǎng)至OD6000.3-0.4,離心(5K,5)收集菌體加入預冷CaCl2(10ml 100mM)冰浴20離心收集菌體加入100ul100mM預冷CaCl2混勻加甘油保存-80度,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,轉化方法: 原生質體轉化法 除去細胞壁后加外源DNA,經吸收恢復再生培養(yǎng),如枯草桿菌 化學轉化法(CaCl2法) 冰浴30mi

30、n42 90s冰浴2min加37預熱LB 培養(yǎng)45min,取50-200ul/皿涂布,37倒置培養(yǎng)過 夜,觀察細菌生長情況 電穿孔法 原理:利用高壓脈沖電場,在宿主細胞表面形成暫 時性的微孔,質粒DNA可乘隙而入,脈沖過后,微孔 復原. 操作更簡單,轉化效率高,不僅無需制備感 受態(tài)細胞,而且適用于任何菌株.,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,三.轉化子的篩選與鑒定,轉化子,重組子,陽性克隆:都指帶有重組質粒(含目的基因)的菌株,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Y

31、antai University,1.抗藥性篩選重組體,利用遺傳標志的表型特征篩選,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2.-半乳糖苷酶(LacZ)基因失活篩選法,非重組質粒:不含有插入的DNA 藍色菌落 重組質粒:含有插入的DNA:白色菌落,非重組質粒,重組質粒,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,(二)根據重組子的結構特征篩選 1) 重組子大小鑒別篩選 菌落提取質粒電泳 2) 酶切鑒定 菌落提取質粒雙酶切電泳 3) PCR篩選法

32、 能與插入基因片斷兩端互補的特異引物,以少量抽提的重組子DNA為模板,進行PCR分析 4)測序,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,原位雜交,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,一 疾病基因的發(fā)現與克隆 根據基因定位克隆之并研究其性質,而認識疾病的分子機制.,第六節(jié) 基因工程和醫(yī)藥,2020年8月6日2時6分,煙臺大

33、學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,二 生物制藥,基因工程可大量生產天然稀有存在的 重要的肽或蛋白質.,基因工程可根據人的意愿設計生產出天然不存在的有重要生物活性的肽或蛋白質.,人類基因組計劃及后基因組計劃的成果 將為基因工程提供難于估量的廣闊發(fā)展空間.,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,重組DNA醫(yī)藥產品,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,三 基因診斷,基因診斷(genetic

34、diagnosis)是利用分子生物學及分子遺傳的技術和原理,在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變. 發(fā)現并獲得某種疾病的特異性基因 是基因診斷的基礎.,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,四 基因治療(gene therapy),基因治療的策略,1.基因置換:以正常基因替換缺陷基因.,一切通過基因水平的操作而達到, 治療疾病目的療法.,2.基因補償:導入正?；?補償缺陷基 因的功能.,3.基因失活:用反義核酸封閉有害基因 的表達.,定義:,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,1.目的基因的表達水平太低或難于精確控制.,2.目的基因的轉移和表達缺乏足夠的 靶向性.,3.對基因表達調控、基因表達產物的功能的認識還很少.,目前基因治療面臨的問題,2020年8月6日2時6分,煙臺大學藥學院 School Pharmacy of Yantai University,補充 ：多利誕生的過程 1