1、.,1,HIV感染和 AIDS的實(shí)驗(yàn)診斷,.,2,HIV感染及AIDS的實(shí)驗(yàn)診斷,.,3,揭開(kāi)AIDS歷史的 第一頁(yè) MMWR JUNE 5,1981/VOL.30/NO.21 MORBIDITY AND MORTALITY WEEKLY REPORT,.,4,愛(ài)滋病是一種有病毒引起的全身性傳染病,其定義是血液中查到人類免疫缺陷病毒抗體或其他相關(guān)的病毒學(xué)指標(biāo),機(jī)體抵抗感染和疾病的免疫機(jī)能受到破壞，而發(fā)生的一系列相應(yīng)癥狀 HIV感染者的定義是血液呈HIV陽(yáng)性而無(wú)癥狀的感染者。,獲得性免疫缺陷綜合征 (Acquired immuno-deficiency Syndrome, AIDS),.,5,1

2、.發(fā)展簡(jiǎn)史 1983年,法國(guó)巴斯德研究所分離到一種新的 逆轉(zhuǎn)錄病毒，命名為L(zhǎng)AV。1984年美國(guó)國(guó)立 癌腫研究所分離出命名為HTLV-的病毒。 同年，美國(guó)加州大學(xué)分離出AIDS相關(guān)病毒 （AIDS Related Virus,ARV）.1986年， 非洲西部發(fā)現(xiàn)了另一種病毒 國(guó)際微生物學(xué)會(huì)及病毒分類學(xué)會(huì)統(tǒng)一命名為HIV。,一）生物學(xué)特征,.,6,2.HIV的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)功能 HIV呈球形或卵形，直徑為100-120nm，雙層結(jié)構(gòu)。核心由兩個(gè)相同拷貝的RNA及蛋白質(zhì)、反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶及整合酶組成，核心外為病毒衣殼，20面體立體對(duì)稱，有蛋白質(zhì)（P17/P18、P24/P25）。最外層是膜蛋白。

3、包膜上有刺突，含糖蛋白gp120，在雙層脂質(zhì)中有 gp41 。,一）生物學(xué)特征,.,7,HIV病毒顆粒及其結(jié)構(gòu)蛋白和其他毒粒蛋白,.,8,人類免疫缺陷病毒HIV,.,9,HIV基因編碼的產(chǎn)物及其功能,.,10,HIV結(jié)構(gòu)蛋白包括:核心蛋白(gag),包膜蛋白(env ) 聚合蛋白(pol)。 核心蛋白包括: P17位于核蛋白與殼層之間的基質(zhì)上，包被于包膜蛋白的內(nèi)部。P24和P15包被于內(nèi)部核酸外圍核衣殼主要為P24。 包膜蛋白為糖蛋白: gp160 是前體分子，在感染初期產(chǎn)生，然后分解成 gp120 和gp41。 聚合酶蛋白包括: P66、P51和P31，聚合酶抗原位于病毒的核區(qū)內(nèi)，與病毒核酸

4、緊密相關(guān)。其功能為轉(zhuǎn)錄RNA為DNA；整合病毒DNA到宿主細(xì)胞的DNA上和切割前體分子使之成為有活性的小分子。,HIV 的結(jié)構(gòu)蛋白,.,11,HIV-1分為M、O、N三組，M組包括A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10個(gè)亞型，加上O、N型共12個(gè)亞型。 HIV-2至少有A、B、C、D、E、F 等6個(gè)亞型。,3. HIV的病原特異性：,.,12,HIV亞型,A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,O,HIV2,SIV,Adapted from : J. Levy HIV and the Pathogenesis of AIDS,HIV1,.,13,HIV-1 亞型全球分布,B,a,c,d,

5、f,o,A,O,d,g,h,B,a,d,e,o,B,B,B,B,B,f,c,B,e,B,C,A,D,e,C,a,d,C,a,b,e,C,E,b,E,b,B,e,c,B,e,B,a,c,d,g,h,B,i,UNAIDS Dec. 1996,非洲及亞洲部分地區(qū) 有重組株病毒。,.,14,HIV的亞型特點(diǎn),有相對(duì)優(yōu)勢(shì)亞型 同一亞型差異很大 亞型內(nèi)的變異水平估算存在時(shí)間 不同亞型傳播途徑和致病性不一 不同亞型對(duì)抗-HIV藥物引起耐藥不同 亞型重組,.,15,屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，復(fù)制速度快 可感染人體各種細(xì)胞，造成多器官損傷 破壞具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能T4淋巴細(xì)胞 在血液、淋巴液、精液、陰道分泌液和乳汁中 其

6、抗體無(wú)保護(hù)作用 對(duì)外界抵抗力弱（低于乙肝病毒）,人類免疫缺陷病毒,.,16,1.艾滋病成為全球第四大殺手，傳染性疾病 的第一大殺手奪取了超過(guò)280萬(wàn)人的性命； 2.截止2008年，15-49歲HIV患病人數(shù)已有4000萬(wàn)，其中40%是15-24歲的青年.(有120萬(wàn)兒童) 3.亞洲人感染艾滋病的增長(zhǎng)速度最快，尤其 是中國(guó)和印度； 4. HIV的研究仍跟不上其破壞的速度； 5.治療性控制是可以達(dá)到的。,二）流行病學(xué),.,17,全球愛(ài)滋病感染人數(shù)及感染途徑,根據(jù)聯(lián)合國(guó)愛(ài)滋病委員會(huì)和世界衛(wèi)生組織 統(tǒng)計(jì)，全球每年新感染愛(ài)滋病帶毒者410萬(wàn) 。(24h全球增加16000感染者) 因HIV死亡的人數(shù)超過(guò)了

7、280萬(wàn),已超過(guò)了 肺結(jié)核(病死率200萬(wàn))和瘧疾(100萬(wàn)).,.,18,1.西方國(guó)家HAART的使用，患病率和病死率在下降，而發(fā)展中國(guó)家AIDS形勢(shì)嚴(yán)峻； 2.以注射吸毒和性傳播(以異性間的傳播為主)； 3.不潔的血液采集; 4.女性病例上升；母嬰傳播 5.兒童病例增加（15歲）。,近年AIDS流行特點(diǎn)：,.,19,AIDS的流行情況,.,20,全國(guó)愛(ài)滋病患者報(bào)告人數(shù)已超過(guò)65萬(wàn)人 2008年新感染人數(shù)已超過(guò)7萬(wàn)人 31省市自治區(qū)全部發(fā)現(xiàn)HIV感染者 三種傳播途徑均已存在 全國(guó)愛(ài)滋病的流行經(jīng)過(guò)散發(fā)期（1985-1988）、局部流行期（1989-1994），現(xiàn)已進(jìn)入廣泛 流行期（1995至今

8、） 愛(ài)滋病已成為名副其實(shí)的第三世界疾病.,中國(guó)的愛(ài)滋病近況：,.,21,蘇州市自92年起共發(fā)現(xiàn)艾滋病例600多例,而去年一年的新感染者達(dá)190余例,這些統(tǒng)計(jì)數(shù)字充分表明了我國(guó)目前真可謂艾滋病病毒感染的 迅速增長(zhǎng)期。(體檢發(fā)現(xiàn)) 聯(lián)合國(guó)艾滋病中國(guó)專題組在北京以中國(guó)艾滋?。何ｋU(xiǎn)的泰坦尼克號(hào)為題發(fā)布了2001年中國(guó)艾滋病形勢(shì)的最新報(bào)告。報(bào)告警告說(shuō)，中國(guó)正處在艾滋病災(zāi)難的邊緣，一艘巨輪正在沖向冰山。,.,22,1.HIV借助CD4受體結(jié)合到靶細(xì)胞表面，通過(guò)靶細(xì)胞的內(nèi)吞作用和 gp 41的融合作用，其細(xì)胞膜被穿透，病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)； 2.在RT作用下，第一條RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，繼之以第一條DNA為模板，形

9、成前病毒； 3.在整合酶作用下，形成的雙股DNA整合到宿主細(xì)胞中，感染持續(xù)存在； 4.前病毒成為潛伏狀態(tài)； 5.前病毒DNA復(fù)制，具有新一代病毒的遺傳物質(zhì)； 6.復(fù)制好的新病毒顆粒，再感染別的細(xì)胞，而原感染的細(xì)胞死亡,三）致病機(jī)制,.,23,2. HIV的感染過(guò)程,.,24,HIV感染/AIDS過(guò)程,窗口期（1-3月） 無(wú)癥狀攜帶階段，6-15年或更長(zhǎng) 人體感染HIV后大多經(jīng)年潛伏期 （愛(ài)滋病前期） 愛(ài)滋病期-機(jī)會(huì)性感染及機(jī)會(huì)性腫瘤 HIV感染者及AIDS病人均具傳染性,.,25,1.“窗口期”: 感染HIV到相應(yīng)抗體產(chǎn)生. 2. “急性感染期” : 一般在一月后產(chǎn)生抗體，平均45天。在急性感

10、染期病毒復(fù)制明顯，血中?？沙霈F(xiàn)P24抗原和HIV RNA，也可培養(yǎng)到HIV。 3.“潛伏期”: 可持續(xù)數(shù)月至17年以上。此時(shí)僅能檢出抗體，但有低濃度HIV復(fù)制。 4. AIDS臨床階段。,急性HIV感染誘導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答的進(jìn)程,HIV的感染過(guò)程,.,26,HIV的感染過(guò)程,.,27,感染初期，出現(xiàn)病毒血癥，可檢出HIV和HIV RNA； 血清陽(yáng)轉(zhuǎn)后可檢出多種結(jié)構(gòu)蛋白引起的相應(yīng)抗體，如P24、P55、gp160、 gp120、gp41、P51 等，均為 IgG； 抗HIV IgM出現(xiàn)峰度很低，持續(xù)時(shí)間短； 抗 gag 抗體，如P55、P24是常規(guī)篩選和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)最早檢出的抗體；(平均22天) 一般

11、均出現(xiàn)血液淋巴細(xì)胞下降。CD4細(xì)胞數(shù)目為最重要反映臨床進(jìn)展的指標(biāo)； HIV感染者2 m 和新蝶呤水平升高并與其 病程有關(guān)。,3.感染后的免疫反應(yīng),.,28,HIV感染后的血清學(xué)變化,1.血清中的HIV抗原在感染后3-4周達(dá)到高峰，9-10周逐漸降低甚至消失。HIV抗體出現(xiàn)并維持高水平多年，尤以P41時(shí)間最長(zhǎng)； 2.HIV抗原消失或極少往往表示病毒的潛伏期，在血清中再次大量出現(xiàn)可能已是AIDS晚期。此時(shí)HIV抗體下降。,HIV感染的血清學(xué)變化,.,29,4.HIV感染后的T細(xì)胞變化,CD4+T持續(xù)不斷下降，及Th1,Th2亞群失調(diào)對(duì)抗原反應(yīng)性減低細(xì)胞因子如IFN-r,TNF-a水平 升高，產(chǎn)生細(xì)

12、胞因子的功能受損，如IL1,IL2能力下降； CD8+T早期有較明顯上升，發(fā)病前1-2年明顯下降，CTL功能下降，但如加IL-2處理可恢復(fù)活性。 CD3+T在早期下降不明顯，在AIDS發(fā)病前1-2年出現(xiàn)明顯下降。,.,30,CD4+淋巴細(xì)胞的格局,.,31,HIV的病毒培養(yǎng)與分離； HIV的毒株分析； HIV核酸測(cè)定；（Abbott LCx HIV-RNA） P24抗原的測(cè)定；第四代酶免試劑 HIV抗體測(cè)定：常分為初篩和確認(rèn)兩步。 初篩實(shí)驗(yàn)室和常用初篩方法有： HIV病毒抗體金標(biāo)快速法（Instant CHEK-HIV1+2） 愛(ài)滋病毒抗體篩選酶免試劑（MUREX HIV） Determine

13、 HIV1+2+0亞型試紙（Abbott） 雙抗原夾心酶免試劑 確認(rèn)試驗(yàn)主要是免疫印跡技術(shù)（Western Blot,WB）,四）HIV的實(shí)驗(yàn)診斷,.,32,1.HIV抗體檢測(cè),試劑盒 1985.3 HIV-1 1990.6 HIV-2 1992.4 HIV-1/2 敏感度和特異度不斷提高三代ELISA均達(dá)99%以上 . 1998. 三代ELISA檢測(cè)IV1/HIV2(P24Ab) . 2008. 四代ELISA (IV1/HIV2 (P24Ag) 快速診斷試劑(膠體金標(biāo)記),.,33,EIA實(shí)際試劑盒進(jìn)展,代次 抗原 方法 檢測(cè)時(shí)間 1 全病毒 間接 2個(gè)月 2 重組或多肽 間接 42-45

14、d 3 重組+多肽 夾心 22d 4 抗原+抗體 夾心 16d(抗原5pg) 5 基因擴(kuò)增法，基因芯片 6-11.5d,.,34,HIV抗體篩查試劑,1. Murex HIV 1.2.O： 第三代抗體試劑的雙抗原夾心法模式 兩步法酶標(biāo)法測(cè)試， 可以用來(lái)檢測(cè)HIV抗體I型，II型和O亞型。 手工/自動(dòng)化酶標(biāo)儀檢測(cè)，用血清/血漿樣本。,.,35,Murex HIV-1.2.O. 夾心模式,板底,樣本,結(jié)合物,抗原包被（1）,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗原（2）,模式：雙抗原夾心法。,.,36,Murex HIV-1.2.O 抗原,HIV-1 env,POD,POD,POD,HIV-O,HIV-2,多肽抗原

15、,重組抗原,板,結(jié)合物,CD SD,POD,HIV-1 p24,P41/p36,.,37,前帶/后帶效應(yīng)的機(jī)制,兩步?jīng)_洗法-可避免此效應(yīng),低濃度的結(jié)合物,高濃度的結(jié)合物,.,38,HOOK效應(yīng)的機(jī)制,Ag 變構(gòu)是二步夾心酶免出現(xiàn)鉤狀HOOK的原因 被測(cè)抗原如具有多重決定族與親和性高于包被抗體的酶標(biāo)抗體發(fā)生交叉重疊結(jié)合，由于立體效應(yīng)和互相擠壓， Ag分子發(fā)生構(gòu)象改變而從包被抗體上脫落，造成反應(yīng)信號(hào)下降,.,39,2.POCT 在艾滋病毒檢測(cè)中的應(yīng)用,快速Determine HIV1/2 O抗體檢測(cè),第三代抗體試劑的雙抗原夾心法模式 可以用來(lái)檢測(cè)HIV抗體I型，II型和O亞型。 可用手指/靜脈血，

16、15分鐘出結(jié)果，可用血清/血漿/全血樣本結(jié)果可密封保存。,.,40,.,41,.,42,.,43,快速試劑研制的背景,就地檢測(cè)（POCT）概念： 急診-手術(shù)，緊急輸血，事故緊急檢測(cè)。 （醫(yī)護(hù)人員和病人的保護(hù)） 篩查概念： 母嬰篩查，就職，移民，性及吸毒犯罪人員體檢等-簡(jiǎn)單易用。 日常檢測(cè)： 大，中，小型實(shí)驗(yàn)室，及極少量HIV樣本實(shí)驗(yàn)室，偏遠(yuǎn)地區(qū)，實(shí)驗(yàn)室條件或設(shè)備不齊，外出檢測(cè)-方便攜帶，使用。 結(jié)果可保存。,.,44,靈敏度排名及分?jǐn)?shù),.,45,3. 第四代試劑及抗原有關(guān)的試劑,HIV 抗原/抗體聯(lián)合試劑： Murex HIV Ag/Ab：第四代試劑 大大提高靈敏度的篩查試劑，進(jìn)一步縮短了 檢

17、測(cè)“窗口期” 。 RIA Delta HIV Ag/Ab：放免HIV抗原/抗體聯(lián)合試劑。 HIV抗原試劑： Murex HIV抗原單克隆試劑： 臨床上只用于HIV抗原檢測(cè)以早期檢測(cè)樣本， 或觀察HIV 疾病進(jìn)程。 Murex HIV 抗原確認(rèn)試劑,確認(rèn)抗原試劑陽(yáng)性樣本。,.,46,HIV 標(biāo)記物,CDC group I,CDC group II/III,CDC group IV,HIV Ag/RNA,IgM,IgG (env),IgG (p24),HIV Ag/RNA,第一代,第二代,第三代,第四代,抗原補(bǔ)充,.,47,.,48,.,49,4. HIV特殊試劑,HIV 抗體WB確認(rèn)試劑： 為唯

18、一一種經(jīng)典和全球公認(rèn)的抗體確認(rèn)試劑，2.2版本包含有極早期血清轉(zhuǎn)換片段，便于早期樣本的確認(rèn)。 LCx HIV 核酸物質(zhì)定性/定量分析： （LCR和PCR技術(shù)） 用于HIV 病人遺傳物質(zhì)檢測(cè)，可用于部分確認(rèn)，和病人治療監(jiān)測(cè)。,.,50,Western Blot分析HIV 蛋白,.,51,Western blot原理,.,52,.,53,HIV病毒核酸分析和血清學(xué)免疫測(cè)定比較,血清學(xué)免疫測(cè)定 核酸分析,感染后天數(shù),天,血清HIV抗體,核酸分析,.,54,5.自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)原理,雙功能試劑：抗RBC,gp120 簡(jiǎn)單，快速，微量，不需分離血清 有假陽(yáng)性,.,55,6. HIV亞型分析； HIV變異的識(shí)別； 7. 細(xì)胞因子的測(cè)定； 8. PCR追蹤HIV自然感染史。,HIV的實(shí)驗(yàn)診斷,.,56,世界愛(ài)滋病日,1988年月將每年的月日定為世界愛(ài)滋病日，