1、顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理。 2學(xué)習(xí)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。 二、實(shí)驗(yàn)材料 酵母菌懸液，血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無(wú)菌毛細(xì)管、吸水紙等。,三、實(shí)驗(yàn)原理 利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（0.13），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)?yè)Q算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。,血球計(jì)數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上

2、由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。,計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，共400小格；另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，總共也是400小格。所以無(wú)論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都是相同的。 每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1，則每一大方格的面積為12，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.13。,推導(dǎo)：1mm1mm方格的計(jì)數(shù)1mm1mm表示

3、計(jì)數(shù)室的邊長(zhǎng)，即一個(gè)大方格的邊長(zhǎng)。由于計(jì)數(shù)室厚度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的總體積為0.1mm3。,11625型的計(jì)數(shù)公式： 酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)1mL=100個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/ 100 40010000稀釋倍數(shù),22516型的計(jì)數(shù)公式： 酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)1mL80個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/ 80 40010000稀釋倍數(shù),假設(shè)：計(jì)數(shù)室內(nèi)酵母菌為a個(gè)，稀釋倍數(shù)為b，則10mL培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)為： a105b,例4、通常用血球計(jì)數(shù)板對(duì)培養(yǎng)液中酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，若計(jì)數(shù)室為1mm1mm0.1mm方格，由400個(gè)小方格組成，如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過(guò)多，難以計(jì)數(shù)，應(yīng)先 后再計(jì)數(shù)。若多次重復(fù)計(jì)數(shù)后，算得每個(gè)小方格中平均有5個(gè)酵

4、母菌，則10mL該培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)有 個(gè)。 （參考答案：稀釋；2108） 540010000102108 。,例6、 在用血球計(jì)數(shù)板（2mm2mm方格）對(duì)某一稀釋50倍樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在一個(gè)計(jì)數(shù)室內(nèi)（蓋玻片下的培養(yǎng)液厚度為0.1mm）酵母菌平均數(shù)為16個(gè)，據(jù)此估算10mL培養(yǎng)液中有酵母菌 個(gè)。,（參考答案： 2107）,四、操作過(guò)程,1稀釋 將酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。 2鏡檢計(jì)數(shù)室 在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。,3加樣品 將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的細(xì)口滴管將稀釋的酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過(guò)多）

5、，使菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。靜置510分鐘即可計(jì)數(shù)。,4顯微鏡計(jì)數(shù) 將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有510個(gè)菌體為宜。若選用2516規(guī)格的計(jì)數(shù)板則每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中方格，可選4個(gè)角和中央的中格（即80個(gè)小格），若選用1625規(guī)格的計(jì)數(shù)板，則數(shù)四個(gè)角：左上、右上、左下、右下的四個(gè)中方格，（即100小格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半

6、時(shí)，即作兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。,5.對(duì)每個(gè)樣品計(jì)數(shù)三次，取其平均值，計(jì)算每1ml菌液中所含的酵母菌個(gè)數(shù)。,A-五個(gè)中方格的總菌數(shù) B-稀釋倍數(shù),6清洗血球計(jì)數(shù)板 血球汁數(shù)板使用后，用自來(lái)水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95的乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過(guò)鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。,7.注意事項(xiàng),（1）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，如何稀釋？ 如果發(fā)現(xiàn)每小格中酵母菌的個(gè)數(shù)多于10個(gè)，可按以下處理：取1ml酵母菌培養(yǎng)液加入到盛有9ml蒸餾水的試管中，搖勻，再計(jì)數(shù)；如發(fā)現(xiàn)酵母菌的個(gè)數(shù)仍然過(guò)大，則同樣再稀釋一次，直至每小格中酵母菌的個(gè)數(shù)介于5-10，并作記錄。,（2）調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計(jì)數(shù)室