1、第四章 微生物培養(yǎng)基,第一節(jié) 培養(yǎng)基選擇和配制的原則 第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基 第三節(jié) 培養(yǎng)基的滅菌,第一節(jié) 培養(yǎng)基選擇和配制的原則,培養(yǎng)基是人工配制的供微生物或動植物細胞生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的、一定比例的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物，同時培養(yǎng)基也為微生物等提供除營養(yǎng)外的其他生長所必須的環(huán)境條件。 培養(yǎng)基組成對菌體生長繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離精制乃至產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量都有重要的影響。 所有發(fā)酵培養(yǎng)基都必須提供微生物生長繁殖和產(chǎn)物合成所需的碳源、氮源、無機元素、生長因子、水和氧氣等。 大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中還必須重視培養(yǎng)基原料的價格和來源。,一、培養(yǎng)基的類型和用途,根據(jù)來源分： 根據(jù)主要成分或使

2、用目的分： 根據(jù)生產(chǎn)工業(yè)的要求分：,營養(yǎng)不能太豐富，尤其是有機氮源； 無機鹽濃度要適量，否則會影響孢子量和孢子顏色； 注意pH和濕度,營養(yǎng)要求比較豐富和完全，氮源和維生素含量也要高一些,除含有菌體生長所必須的營養(yǎng)物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體物質(zhì)和促進劑等,二、培養(yǎng)基類型的選擇,從微生物的特點來選擇 液體和固體培養(yǎng)基選擇 從生產(chǎn)實踐和科學試驗的不同要求選擇 從經(jīng)濟效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料,三、培養(yǎng)基的配制原則,根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基 注意速效碳（氮）源和緩效碳（氮）源的配合使用，發(fā)揮各自的優(yōu)勢 營養(yǎng)成分的恰當配比（C/N一般取100 : 0.22.0） 滲透壓，營養(yǎng)物質(zhì)

3、要有合適的濃度 合適的pH值（注意生理酸性鹽、生理堿性鹽和緩沖劑的加入） 氧化還原電位 考慮營養(yǎng)成分的加入順序，避免生產(chǎn)沉淀,四、培養(yǎng)基成分配比的選擇,參照前人所使用的較適合于某一類菌種培養(yǎng)基的經(jīng)驗配方 結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性 采用搖瓶、玻璃瓶等小型發(fā)酵設備，對碳、氮、無機鹽和前體等進行逐個單因子試驗 觀察這些因子對菌體生長和產(chǎn)物合成量的影響 綜合考慮各因素的影響 得到一個適合該菌種的培養(yǎng)基配方以得到高產(chǎn),正交試驗設計減少試驗次數(shù)，確定培養(yǎng)基組分和濃度,方差分析了解哪些因素影響大，以引起注意,四、培養(yǎng)基成分配比的選擇,氮源過多，菌體繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累； 氮源不足，菌體

4、繁殖量少，影響產(chǎn)量。 碳源過多，容易形成較低的pH值； 碳源不足，菌體衰老和自溶。 C/N不當影響菌體按比例吸收營養(yǎng)物質(zhì)，直接影響菌體生長和產(chǎn)物形成。,注意速效碳、氮源和緩效碳、氮源的相互配合，選用適當?shù)腃/N。,一般發(fā)酵工業(yè)中C/N為100:（0.22.0） 但對于氨基酸生產(chǎn)，由于產(chǎn)物中含氮較多，因此C/N就要適當調(diào)整，如100:（1521）,第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基,消耗每克底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率 能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體的濃度 能以最大的速率產(chǎn)生產(chǎn)物 副產(chǎn)品的得率最小 價廉并具有穩(wěn)定的質(zhì)量 來源豐富且供應充足 易于通氣和攪拌 提取、純化、廢物處理等生產(chǎn)工藝過程都比較容易,在發(fā)酵工

5、業(yè)中，必須使用廉價的原料來配制培養(yǎng)基，使之盡可能滿足下列條件：,一、工業(yè)上常用的碳源,在微生物發(fā)酵過程中，普遍以碳水化合物作為碳源。,生產(chǎn)疫苗時通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白質(zhì)作為碳源。,酒精、簡單的有機酸、烷烴等含碳物質(zhì)也可作為碳源。,甲醇作為底物生產(chǎn)單細胞蛋白（SCP） 用烷烴進行有機酸、維生素等的生產(chǎn),碳源供給菌體生命活動所需的能量和構(gòu)成菌體細胞以及代謝產(chǎn)物。,二、工業(yè)上常用的氮源,無機氮源：氨水，銨鹽，硝酸鹽等 有機氮源：玉米漿，豆餅粉，花生餅粉，棉籽粉，魚粉，酵母浸出液等,氮源主要構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)，作為酶的組成成分或維持酶的活性，調(diào)節(jié)滲透壓、pH、Eh等。,三、無機鹽,無機鹽是微生物

6、活動不可缺少的物質(zhì)。 其主要功能是構(gòu)成菌體成分、作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑、調(diào)節(jié)培養(yǎng)滲透壓、調(diào)節(jié)pH值和Eh等。 微生物對無機鹽的需要量很少，但無機鹽含量對菌體生長和產(chǎn)物的生成影響很大。,磷酸鹽 硫酸鎂 鉀鹽 微量元素,磷是某些蛋白質(zhì)和核酸的組成成分。 磷酸鹽在培養(yǎng)基中還具有緩沖作用。 工業(yè)上常用K3PO43H2O、K3PO4和Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O等磷酸鹽，也可用磷酸。, 除了組成某些細胞的葉綠素成分外，并不參與任何細胞物質(zhì)的合成； 處于離子狀態(tài)時，是許多重要的酶（己糖磷酸化酶，檸檬酸脫氫酶、羧化酶等）的激活劑； 不但影響基質(zhì)的氧化，還影響蛋白質(zhì)的合成,

7、鉀離子與細胞滲透壓和透性有關； 是許多酶的激活劑； 促進糖代謝, Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作為酶的輔基和激活劑； 一般作為碳、氮源的農(nóng)副產(chǎn)品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加； 特例：VB12的生產(chǎn)，由于鈷是其組成成分，Co的需要量隨產(chǎn)物的增加而增加，因此在培養(yǎng)基中需加入氯化鈷以補充鈷,四、生長因子,從廣義來說，凡是微生物不可缺少的微量有機物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱為生長因子。 其功能是構(gòu)成細胞的組成分，促進生命活動的進行。 生長因子不是所有微生物都必需的，它只是對于某些自己不能合成這些成分的微生物才是必不可少的營養(yǎng)物。 目前以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸產(chǎn)生菌均為

8、生物素缺陷型，以生物素為生長因子。,提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料,玉米漿 麩皮水解液 糖蜜 酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。,五、前體物質(zhì)和促進劑,1. 前體物質(zhì),某些化合物加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但產(chǎn)物的量卻因加入而有較大的提高。 有些氨基酸、核苷酸和抗生素發(fā)酵必須添加前體物質(zhì)才能獲得較高的產(chǎn)率。,2. 發(fā)酵過程中的促進劑和抑制劑,在氨基酸、抗生素和酶制劑發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中，可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入某些對發(fā)酵起一定促進作用的物質(zhì)，稱為促進劑或抑制劑。,常用促進劑,表面活性劑洗凈劑（脂肪酰胺磺酸鈉）、吐溫80、植酸等

9、 二乙胺四乙酸 大豆油抽提物 黃血鹽 甲醇,促進劑能促進產(chǎn)量增加的原因： 主要是改進了細胞的滲透性，增強了氧的傳遞速度，改善了菌體對氧的有效利用。,在酶制劑發(fā)酵過程中，加入某些誘導物、表面活性劑及其他一些產(chǎn)酶促進劑，可以大大增加菌體的產(chǎn)酶量。,抗生素工業(yè)在發(fā)酵過程中加入某些促進劑或抑制劑，?？纱龠M抗生素的生物合成。,不同促進劑所起的作用：,起生長因素的作用； 可推遲菌體的自溶； 抑制某些合成其他產(chǎn)物的途徑而使之向所需產(chǎn)物的途徑轉(zhuǎn)化； 降低了生產(chǎn)菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成； 改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，改善通氣效果； 可與抗生素形成復鹽，降低發(fā)酵液中抗生素的濃度和促進抗生素的合成等。,第三節(jié) 培

10、養(yǎng)基的滅菌,在工業(yè)微生物培養(yǎng)過程中，只允許生產(chǎn)菌存在和生長繁殖，不允許其它微生物共存，因此所有發(fā)酵過程，必須進行純種培養(yǎng) 整個發(fā)酵過程必須牢固樹立無菌觀念，強調(diào)無菌操作 除了設備應嚴格按規(guī)定保證沒有死角，沒有構(gòu)成染菌可能的因素外，必須對培養(yǎng)基和生產(chǎn)環(huán)境進行嚴格的滅菌和消毒，防止雜菌和噬菌體的污染,滅菌：利用物理和化學的方法殺滅或除去物料及設備中一切生命物質(zhì)的過程。 消毒：用物理或化學的方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病原微生物，一般只能殺死營養(yǎng)細胞而不能殺死芽胞。 消毒不一定能達到滅菌的要求，而滅菌則可達到消毒的目的。 在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中，為了保證純種培養(yǎng)，在生產(chǎn)菌種接種培養(yǎng)前，要對培養(yǎng)基、空氣系

11、統(tǒng)、消泡劑、流加物料、設備、管道等進行滅菌，還要對生產(chǎn)環(huán)境進行消毒，防止雜菌和噬菌體的大量繁殖。 只有不受雜菌污染，發(fā)酵過程才能正常進行。,一、滅菌的方法,干熱滅菌法 火焰滅菌法 電磁波、射線滅菌法 濕熱滅菌法（主要是高壓蒸汽滅菌） 化學藥劑滅菌法 過濾除菌法,進行干熱滅菌時，微生物細胞發(fā)生氧化，微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮引起中毒等作用，氧化作用導致微生物死亡是主要依據(jù)。 由于微生物對于熱的耐受力比對濕熱強得多，故干熱滅菌所需的溫度要高，時間要長，一般160170、11.5h。 實際應用時，對一些要求保持干燥的實驗器具和材料可以采用干熱滅菌法。,利用火焰直接殺死微生物的滅菌法稱為火焰滅菌

12、法。該法方法簡單，滅菌徹底，但使用范圍有限，僅適用于接種針、玻璃棒、三角瓶口等的滅菌。,利用電磁波、紫外線、X射線、射線或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子進行滅菌，以紫外線最常用。 紫外線對芽胞和營養(yǎng)細胞都能起作用，但細菌芽胞和霉菌孢子對紫外線的抵抗力強。 紫外線的穿透力低，僅適用于表面滅菌和無菌室、培養(yǎng)室等空間的滅菌，對固體物料滅菌不徹底，也不能用于液體物料的滅菌。 250270nm之間殺菌效率高，以波長在260nm左右滅菌效率最高。 除紫外線外，X射線和射線也可進行滅菌。,一、滅菌的方法,利用飽和蒸汽進行滅菌 原理：水的沸點隨水蒸氣壓力的增加而上升，高壓情況下可獲得高溫的水蒸汽。借助蒸汽的高溫和蒸

13、汽釋放的潛熱使微生物細胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡 從滅菌效果來看，由于蒸汽有很強的穿透能力，濕熱滅菌對耐熱芽胞桿菌來說，溫度升高10時，滅菌速度常數(shù)可增加810倍，對營養(yǎng)細胞更高。另外蒸汽冷凝為水時還要釋放出潛熱，因此溫度可進一步提高 蒸汽來源方便，價格低廉，滅菌效果可靠 濕熱滅菌法是目前最常用的滅菌方法，一般的濕熱滅菌條件為121，30min,某些化學藥劑能與微生物發(fā)生反應而具有殺菌的作用。 化學藥劑適用于生產(chǎn)車間環(huán)境的滅菌，接種操作前小型器具的滅菌等。 化學藥品的滅菌使用方法，根據(jù)滅菌對象的不同有浸泡、添加、擦拭、噴灑、氣態(tài)熏

14、蒸等。,二、濕熱滅菌的原理,1. 微生物的熱阻,每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍，當微生物處于最低限溫度以下時，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。當溫度超過最高限度時，微生物細胞中的原生質(zhì)體和酶的基本成分蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變化，即凝固變性，使微生物在很短時間內(nèi)死亡。 濕熱滅菌就是根據(jù)微生物的這種特性進行的,一般無芽胞細菌，在60下經(jīng)過10min即可全部殺死； 芽胞細菌的芽胞在100下經(jīng)過幾分鐘至數(shù)小時才能殺死； 某些嗜熱菌能在120下耐受2030min。 一般講，滅菌的徹底與否 以 能否殺死芽胞細菌為標準。,二、濕熱滅菌的原理,致死溫度：殺死微生物的最低溫度。 致死時間：在致死溫度下，殺死

15、全部微生物所需的時間。,在致死溫度以上，溫度愈高，致死時間愈短。 由于一般細菌、產(chǎn)芽胞細菌、微生物細胞和微生物孢子對熱的抵抗力不同，因此，它們的致死溫度和致死時間也有差別。,微生物對熱的抵抗力常用“熱阻”表示,熱阻：微生物在某一特定條件下（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。 相對熱阻：某一微生物在某條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。,二、濕熱滅菌的原理,2. 微生物的熱死規(guī)律對數(shù)殘留定律,微生物熱死：指微生物受熱失活直到死亡，主要是由于微生物細胞內(nèi)酶蛋白受熱凝固，喪失活力所致。,在微生物受熱失活的過程中，微生物不斷被殺死，活菌數(shù)不斷被減少。 微生物熱死速率可以用分子反

16、應速率來表示，即微生物活體個數(shù)減少的速度與任一瞬間殘存的菌數(shù)成正比。,二、濕熱滅菌的原理,1/10衰減時間D： 活菌數(shù)在受熱過程中減少到原菌數(shù)的1/10時所需的時間。,隨時間的延長，加熱滅菌后的殘存菌數(shù)呈對數(shù)減少，且溫度越高，死亡越快。通常必要的滅菌時間是110130，520min。 芽胞對熱耐受力強，為此需要更高的溫度并維持更長的時間。 對細菌芽胞來說，并不始終符合對數(shù)殘留規(guī)律，特別是在受熱后很短的時間內(nèi)，培養(yǎng)液中油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)會增加微生物的耐熱性；高濃度鹽類、色素能削減其耐熱性。 隨著滅菌條件的加強，培養(yǎng)基成分的熱變性加速，特別是維生素，因此培養(yǎng)液滅菌一般都采用高溫短時間加熱

17、的方式，這樣可以達到徹底滅菌和把營養(yǎng)成分的破壞減少到最低限度的目的。,滅菌時間取決于污染的程度（N0）、滅菌的程度（殘留菌數(shù)Nt）和k值。,一般考慮產(chǎn)芽胞細菌和細菌的芽胞之和作為計算依據(jù)。 在設計時常采用Nt0.001（即1000次滅菌中有一次失敗的機會）。,反應速率常數(shù)k是微生物耐熱性的一種特征，它隨微生物的種類和滅菌溫度而異。 在相同的溫度下，k值愈小，則此微生物愈耐熱。 同一種微生物在不同的滅菌溫度下，k值不同，滅菌溫度愈低，k值愈低。,在培養(yǎng)基滅菌的過程中，除微生物被殺死外，還伴隨著營養(yǎng)成分的破壞，如糖液焦化變色、蛋白質(zhì)變性、維生素失活、醛基和氨基反應、不飽和醛聚合、一些化合物發(fā)生水解

18、等。因此，必須選擇一個既能達到滅菌的目的，又能使培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分破壞至最小的滅菌工藝條件。,二、濕熱滅菌的原理,3. 培養(yǎng)基滅菌溫度的選擇,c反應物濃度，mol/L； t反應時間，min； k化學反應常數(shù)（隨溫度及反應類型而變），min-1。,A頻率因子； E反應所需的活化能，J/mol； T絕對溫度，K。,雜菌的死亡也屬于一級動力學方程，與上式類似。 一般殺滅微生物營養(yǎng)細胞的E值約為2.091052.71105J/mol； 殺死微生物芽胞的E值約為4.48105J/mol； 一般酶及維生素等營養(yǎng)成分分解的E值為8.361038.36104J/mol。,由于滅菌時的活化能E大于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞的活化能E，因此，隨著溫度升高，滅菌速率常