1、VEGF對(duì)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)歸的影響,中國武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心 穆海玉,前言,肺癌是當(dāng)今世界上對(duì)人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤，隨著傳統(tǒng)化療進(jìn)入了一個(gè)平臺(tái)期，靶向治療引起人們的高度關(guān)注。實(shí)驗(yàn)顯示新生血管生成是腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的解剖學(xué)和生理學(xué)基礎(chǔ)，因此研究可能影響肺癌血管生成的因素，尋找有效的抗血管生成藥物，可望在很大程度上改變肺癌治療的現(xiàn)狀。研究顯示：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor VEGF）是肺癌血管生成的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)采用SP免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)肺癌組織中VEGF的陽性表達(dá)，分析研究它與微血管密度（microvessel den

2、sity MVD）之間的關(guān)系及與臨床病理、組織分型和轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系，以探討VEGF在肺癌血管生成中的作用。,對(duì)象及分組,（1） 肺癌組：共40例，平均年齡52.6歲，其中男21例，女19例。所有患者術(shù)前均未接受放化療。所有標(biāo)本均重新切片后經(jīng)HE染色證實(shí)為肺癌。其中鱗癌21例，腺癌14例，小細(xì)胞未分化癌 5例；高分化20例，中分化7例，低分化8例；期期21例，期期14例。 （2） 肺良性病組：共12例，男9例，女3例；平均年齡49.8歲。標(biāo)本重新切片后經(jīng)HE染色證實(shí)7例為結(jié)核球、5例為肺炎。 （3） 正常對(duì)照組：共10例，男6例，女4例；平均年齡47.6歲。經(jīng)HE染色證實(shí)為正常肺組織。,方法,所

3、有石蠟標(biāo)本均行5切片，連續(xù)切4片，置60度烤箱內(nèi)烤30分鐘。所有切片分別經(jīng)二甲苯脫蠟，無水酒精及其它不同濃度酒精脫苯，自來水洗2分鐘水化。必選一張切片行HE染色核實(shí)病理診斷。采用SP免疫組織化學(xué)染色法，按藥盒操作規(guī)程進(jìn)行。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用武漢博士德生物工程有限公司提供的已知陽性切片作陽性對(duì)照。,結(jié)果判定,VEGF表達(dá)的判定：鏡下癌細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒狀者為陽性，細(xì)胞漿呈透明或無色者為陰性，每張切片中觀察5個(gè)高倍視野200， 每一視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽性染色細(xì)胞10%為陰性，10%為陽性。,MVD的測(cè)定：參考Weidner方法，先在低倍鏡下掃視整個(gè)切片，確定對(duì)FAg明顯著棕褐色微血

4、管密度最高區(qū)，即 “熱點(diǎn)”。然后換成高倍鏡進(jìn)行記數(shù)。凡在腫瘤組織中與鄰近微血管、腫瘤細(xì)胞及其它結(jié)締組織分界清楚的任何一個(gè)染成棕褐色的細(xì)胞或細(xì)胞簇均被認(rèn)為是一個(gè)血管；只要結(jié)構(gòu)不相連，其分枝結(jié)構(gòu)也算作一個(gè)血管。但不能用有無紅細(xì)胞的出現(xiàn)及是否形成管腔來記數(shù)血管數(shù)。已形成明顯肌層的血管不參與計(jì)數(shù)，結(jié)果以3個(gè)視野血管的均數(shù)表示。,計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，所得數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)和方差分析；計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)。,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果1-三種肺組織中MVD分布情況,陽性染色局限于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，呈棕褐色，微血管形態(tài)不規(guī)則，在癌組織中的分布呈異質(zhì)性，大多集中在腫瘤邊緣。,表1 MVD在三種肺組織中的表達(dá),VE

5、GF著色為棕黃色顆粒，陽性染色主要分布于癌細(xì) 胞胞漿中，在腫瘤壞死灶周圍尤為明顯。肺癌組織VEGF陽性率顯著高于肺良性病變和正常對(duì)照組。 見表2,結(jié)果2-VEGF在三種肺組織中的表達(dá),表2 VEGF在三種肺組織中的表達(dá),結(jié)果3 MVD、 VEGF表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系,MVD與原發(fā)腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與病理分型無關(guān)，見表3。 VEGF與原發(fā)腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與組織學(xué)分級(jí)、病理分型無關(guān)，見表3。,表3 非小細(xì)胞肺癌MVD、VEGF表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系,結(jié)果4-肺癌VEGF表達(dá)與MVD的關(guān)系,表4,討論,一、肺癌的微血管密度：腫瘤是代謝高度旺盛的細(xì)胞，在腫瘤發(fā)生的早

6、期，腫瘤細(xì)胞可通過組織滲透而維持其生長(zhǎng)，此期腫瘤處于高增生和高凋亡平衡的休眠狀態(tài)當(dāng)腫瘤直徑1mm后，腫瘤必須產(chǎn)生提供自身營(yíng)養(yǎng)的新血管，血管新生是腫瘤生長(zhǎng)與發(fā)展的必經(jīng)之路,與實(shí)體瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有著不可分割的密切關(guān)系 。應(yīng)用特異性抗體標(biāo)記腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞，記數(shù)單位面積中的微血管數(shù)目，即為微血管密度（MVD），通過它可衡量腫瘤血管生成的活躍程度。,資料報(bào)道：包括肺癌在內(nèi)的腫瘤組織內(nèi)MVD明顯增高，并與預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)。我們的試驗(yàn)顯示：微血管在癌組織中的分布呈異質(zhì)性，大多集中在腫瘤邊緣，肺癌組織MVD顯著高于肺良性病變和正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）， 而肺良性病變和正常組織的MVD無

7、顯著差異。通過比較非小細(xì)胞肺癌不同狀態(tài)下MVD表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)肺癌的MVD與原發(fā)腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫瘤的分化程度密切相關(guān)（p0.01）， 證實(shí)肺癌組織新生血管活躍，MVD是反映和判斷肺癌血管生成狀態(tài)以及臨床轉(zhuǎn)歸的一個(gè)獨(dú)立、相關(guān)性良好的指標(biāo)，,二、肺癌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子高表達(dá)：肺癌血管生成過程主要兩類因子調(diào)節(jié):血管生成促進(jìn)因子和抑制因子，前者中功能最強(qiáng)、作用最直接的是VEGF 。 在肺癌組織中，腫瘤的快速增殖導(dǎo)致細(xì)胞乏氧等一系列因素它誘導(dǎo)VEGF的異常分泌，表現(xiàn)為腫瘤組織內(nèi)的高表達(dá)。,VEGF能夠特異性地與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖、遷移，促使毛細(xì)血管絆形成并向

8、瘤體內(nèi)延伸，誘導(dǎo)腫瘤血管新生，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)大量結(jié)構(gòu)和功能異常的微血管數(shù)量增加，滿足腫瘤對(duì)代謝的需要。 VEGF信號(hào)傳導(dǎo)通路在腫瘤的血管生長(zhǎng)調(diào)控中非常重要，國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)都通過干擾這個(gè)通路來研究調(diào)控腫瘤的血管生長(zhǎng)。,一些研究發(fā)現(xiàn)：無論是在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞、動(dòng)物模型，還是人體腫瘤組織中均有VEGF的高表達(dá)，肺癌組織VEGF表達(dá)的陽性率、陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度均高于癌旁正常組織。本研究檢測(cè)了40例肺癌患者組織標(biāo)本顯示： VEGF主要分布于腫瘤胞漿中，在腫瘤壞死灶中尤為明顯。癌組織中 VEGF陽性率顯著高于肺良性病變組織及正常對(duì)照組織（ p0.01）;肺良性病變組織及正常對(duì)照組織的VEGF陽性率差異無顯

9、著性，表明VEGF與肺癌的血管生成具有極其密切關(guān)系。,三、VEGF的高表達(dá)與臨床特征：VEGF的過表達(dá)促使肺癌組織新生血管增加，而腫瘤新生幼稚血管的結(jié)構(gòu)缺乏完整性，管壁僅排列一層內(nèi)皮細(xì)胞，并且由于缺乏平滑肌，基底膜變薄或消失缺如，肺癌細(xì)胞易于侵蝕血管，使腫瘤細(xì)胞極易脫離母體進(jìn)入血管，造成肺癌的血行轉(zhuǎn)移。學(xué)者們通過對(duì)手術(shù)切除的肺癌患者VEGF表達(dá)高低的測(cè)定以及術(shù)后生存率的觀測(cè)發(fā)現(xiàn)：肺癌患者中VEGF高表達(dá)者的術(shù)后生存時(shí)間較短，且較早復(fù)發(fā)。另外一些研究也顯示：肺癌組織血管新生與患者的生存期密切關(guān)聯(lián)，呈十分良好的相關(guān)性，,通過評(píng)價(jià)非小細(xì)胞肺癌VEGF表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，我們注意到：腫瘤直徑5cm組

10、VEGF陽性率與腫瘤直徑5cm組相比差異顯著（ p0.05） ；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF陽性率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ p0.05） 。這個(gè)結(jié)果表明：在非小細(xì)胞肺癌中，VEGF的高表達(dá)與原發(fā)腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)密切相關(guān) ,是肺癌病灶生長(zhǎng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移極其重要的因素，它的存在使肺癌的預(yù)后向不良方向迅速發(fā)展。,四、 VEGF與MAD的關(guān)系：為進(jìn)一步確定VEGF與肺癌組織血管新生的關(guān)聯(lián)性，我們分析了不同VEGF表達(dá)的組織中MAD的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明：VEGF陽性高表達(dá)組MAD計(jì)數(shù)顯著增高，而VEGF低表達(dá)組MAD則較低，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012），說明VEGF與MAD之間確實(shí)存

11、在正相關(guān)的密切關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了VEGF在促使肺癌新血管生成方面所發(fā)揮的重要作用。,結(jié)論,（1） MVD是評(píng)估和判斷肺癌血管生成狀態(tài)一個(gè)獨(dú)立的、相關(guān)性良好的指標(biāo),它與肺癌的進(jìn)展密切相關(guān)；（2） VEGF在肺癌組織中呈現(xiàn)陽性過表達(dá)， VEGF表達(dá)與MVD具有良好的相關(guān)性；（3）VEGF表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌腫瘤病灶大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與腫瘤的分化程度、病理分型無關(guān)。提示：VEGF通過促使血管新生成而影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展和預(yù)后； VEGF的靶向治療將通過阻斷肺癌血管的生長(zhǎng)，而控制非小細(xì)胞肺癌的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。,參考文獻(xiàn),1 Bun PA，et al. New therapeutic stra

12、tegies for lung cancer：biology and molecular biology come age. Chest 2000，117（4 Suppl 1）：s163-s168 2. Yuan A，et al. Correlation of total VEGF mRNA and protein expression with hitolgic type ，tumor angiogenesis，patient survival and timing of relapse in non-small-cell lung cancer（j）.Int J Cancer，2000，89（3）475-483. 7. SalvenP，et al. High pre-treatment serum level of vscular endothelial growth factor（VEG