1、專題2 細胞工程,其研究工程取得重大進展的有如下幾個方面：,動物細胞工程技術與植物細胞工程技術的原理基本相同,常用的技術手段,動物細胞培養(yǎng),核移植,單克隆抗體,動物細胞融合,1細胞及組織培養(yǎng)技術2換核技術3克隆技術,2.1-動物細胞工程,一、動物細胞培養(yǎng),動物胚胎或幼齡動物的組織、器官,胰蛋白酶處理分散成單個細胞,10代細胞,原代培養(yǎng),無限傳代,遺傳物質(zhì)改變,遺傳物質(zhì)未改變,為什么要分散成單個細胞,為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？,這些組織或器官上的細胞生命力旺盛，分裂能力強且代數(shù)低。,動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？,不能，動物細胞培養(yǎng)只能

2、使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體（現(xiàn)在條件下無全能性）。,為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？,成塊組織有接觸抑制現(xiàn)象，分散了做成細胞懸浮液利于培養(yǎng),細胞懸浮液,原代培養(yǎng),細胞株,細胞系,單個細胞,傳代培養(yǎng),10代細胞,40-50代細胞,無限世代,0代細胞,細胞名稱,培養(yǎng)代數(shù),培養(yǎng)形式,過程：從動物機體中取出組織 剪碎 加胰蛋白酶 細胞游離 加培養(yǎng)液 將細胞接種到培養(yǎng)瓶內(nèi) 培養(yǎng)（12天換一次培養(yǎng)液） 細胞貼壁生長 長成單層細胞,原代培養(yǎng) (primary culture),原代培養(yǎng),原代培養(yǎng) ：,從機體內(nèi)取出的第1代細胞培養(yǎng)到第10代以內(nèi)的細胞的培養(yǎng)。,傳代培養(yǎng)：,將細胞從一個培養(yǎng)瓶

3、轉移或移植到另一個培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。 或 將原代培養(yǎng)細胞分成若干份，接種到若干培養(yǎng)基上，使其繼續(xù)生長，繁殖。,細胞株,從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的，具有特定性質(zhì)或標志的細胞群，能傳到40-50代。遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生變化。,培養(yǎng)到40-50代后的部分發(fā)生突變或轉化的細胞，能無限制的繁殖下去。遺傳物質(zhì)發(fā)生了變化，帶有癌變的特點。 或指可連續(xù)傳代的細胞。,細胞株：,細胞系：,細 胞懸浮液,10代細胞,50代細胞,無限傳代,原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),細胞株,細胞系,如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細胞株和細胞系？,隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖,(遺傳物質(zhì)改變),(人教版),培養(yǎng)的細胞為什么會貼壁生長？,大多數(shù)組織細

4、胞不適應懸浮生長，他們必須在固體的表面上生長和分裂。 貼壁生長后隨細胞數(shù)目的增多，會出現(xiàn)接觸性抑制的現(xiàn)象。 要定期要胰蛋白酶處理使細胞從瓶壁脫離，配成懸浮液，分裝多瓶再培養(yǎng),動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,用胰蛋白酶處理動物胚胎或幼齡動物的組織、器官？,分解彈性纖維,細胞貼壁,細胞貼壁： 細胞培養(yǎng)時，懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。 要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。 細胞的接觸抑制： 當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖的現(xiàn)象。,動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋

5、白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官（接觸抑制現(xiàn)象）。,為什么動物組織細胞要用胰蛋白酶處理？,為什么要定期用胰蛋白酶使細胞從瓶壁上脫離下來？,大多數(shù)組織細胞不適應懸浮生長，它們必須在固定的表面上生長和分裂。細胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長，隨著細胞越來越多，當貼壁生長的細胞分裂生長到表面相互接觸時就停止分裂增長，這種現(xiàn)象叫做接觸抑制。需要定期用胰蛋白質(zhì)酶使細胞從壁上脫下來，傳代培養(yǎng)。,胰蛋白酶會消化細胞嗎？,胰蛋白酶除了可以消化細胞間的蛋白質(zhì)外，長時間作用也會消化細胞膜蛋白，對細胞有損傷作用；作用時間太短，細胞不容易脫落，因此必須控制好作用時間。實際應用中的處理：做預實驗，摸清效果最好

6、時的胰蛋白酶的用量和作用時間。,動物細胞培養(yǎng)條件：,1、無菌、無毒的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液） 2、營養(yǎng) （葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等。） 3、溫度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 4、氣體環(huán)境： O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ）,保證細胞順利的生長增殖,植物細胞和動物細胞培養(yǎng)的比較,獲得細胞或細胞分泌蛋白,細胞的全能性,細胞株、細胞系,植物體,快速繁殖、培育無病毒植株等,葡萄糖、動物血清,蔗糖、植物激素,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,細胞增殖,1、 為何細胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長？ 2、為何要定期用胰蛋白酶使細胞從瓶壁上 脫離下來，為何要攪

7、拌？ 3、比較動物和植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基的成分.,細胞有接觸抑制的現(xiàn)象,分散成單個細胞便于從培養(yǎng)液中獲得營 養(yǎng)， 排出代謝廢物，利于繼續(xù)培養(yǎng),都有糖、氨基酸、促生長因子、 無機鹽、微量元素等 動物細胞培養(yǎng)液中 還需加入動物血清、血漿等天然成分。,為什么對動物細胞進行培養(yǎng)時通常要添加血清？,血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等多種營養(yǎng)； 還含有多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他 活性物質(zhì)，能促進細胞的生長、增殖和貼附。因此， 細胞培養(yǎng)時，一般需添加10%20%的血清。,細胞培養(yǎng)的方式：,1、群體培養(yǎng)： 將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細胞層

8、。 2、克隆培養(yǎng)（細胞克隆）： 把一個細胞從群體中分離出來單獨培養(yǎng)，使之繁衍成一個新的細胞群體的技術。 一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。,獲得的細胞系具有異質(zhì)性。,獲得的細胞系是純系。,細胞培養(yǎng)中 “危機”出現(xiàn)的原因,干細胞：理論上是指具有無限自我更新能力（有細胞周期）和多方向分化潛能的一類細胞。,按照出現(xiàn)階段可分為: 胚胎干細胞：取自囊胚的內(nèi)細胞層，具有全能性 即具有分化為幾乎全部組織和器官 的能力。 成體干細胞：取自成體細胞，如造血干細胞。,按分化能力可分為 全能干細胞:如受精卵，胚胎干細胞 多能干細胞:如造血干細胞，神經(jīng)干細胞 專能干細胞:如肌肉中的成肌干細胞,受精卵至早

9、期胚細胞,細胞分裂、分化,細胞分裂、分化,代數(shù)低,代數(shù)高,受精卵,全能干細胞,代數(shù)低,代數(shù)高,動物胚胎發(fā)育的早期，動物細胞在進行細胞分裂的過程中，隨著代數(shù)的增高，子細胞中有一部分細胞進行了細胞高度分化，分化成了各種組織細胞；一部分細胞進入了休眠期，使其細胞代數(shù)停留不變，還有一部分細胞繼續(xù)進行分裂并分化成代數(shù)較高的各種專能干細胞。 動物體細胞分裂能力一般為60代，不同生物的體細胞分裂一代所用時間不同。,二、動物細胞培養(yǎng)技術的應用,（2）獲得大量自身的皮膚細胞，用于植皮。,（1）生產(chǎn)蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。,生產(chǎn)病毒疫苗：利用動物細胞培養(yǎng)獲得的細胞作為病毒的宿主，培養(yǎng)脫毒的病

10、毒疫苗。 生產(chǎn)蛋白生物制品：利用雜交瘤細胞生產(chǎn)干擾素、單克隆抗體等。,利用貼壁生長和接觸抑制原理，為大面積燒傷病人移植取自病人皮膚的健康細胞培養(yǎng)的自身皮膚細胞，避免免疫排斥。,（3）獲取干細胞對內(nèi)臟器官進行修復（專能干細胞的體外培養(yǎng)）,（4）用于檢測有毒物質(zhì),將培養(yǎng)到細胞株階段的干細胞，用于器官修復（如心臟功能修復；肝腎功能修復）等。（海軍醫(yī)院曾完成過利用干細胞改善嚴重心衰病人心臟功能的病例）,根據(jù)致畸、致癌物質(zhì)加入培養(yǎng)液后，導致培養(yǎng)細胞發(fā)生染色體變異的細胞占全部培養(yǎng)細胞的百分數(shù)，判斷某種物質(zhì)的毒性。,（5）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預防疾病提供理論依據(jù),醫(yī)學家培養(yǎng)各種正常的或

11、病變的細胞，用于生理、病理、藥理方面的研究（觀察細胞的形態(tài)、結構和代謝方面的變化），為治療和預防疾病提供理論依據(jù)。,（6）成為基因工程的下游工程基因治療,在基因治療中，修復后的患者細胞須經(jīng)過細胞培養(yǎng)增殖成細胞株后，再進行細胞移植。,動物細胞工程的應用：,生產(chǎn)蛋白質(zhì)生物制品,檢測有毒物質(zhì),許多致畸、致癌物質(zhì)加入培養(yǎng)液后，培養(yǎng)細胞會發(fā)生染色體結構和數(shù)目的變異。根據(jù)變異細胞占全部培養(yǎng)細胞的百分數(shù)，可以判斷某種物質(zhì)的毒性。,為燒傷病人植皮 如何利用動物細胞培養(yǎng)技術，解決為燒傷病人植皮問題?,利用動物細胞培養(yǎng)技術中細胞的貼壁生長和接觸抑制特點，可以用燒傷病人自己的健康皮膚細胞培養(yǎng)出大量的自身薄層皮膚細胞

12、供植皮所需。,用于科學研究：生理、病理、藥理,三、動物體細胞核移植技術和克隆動物,1、什么是細胞核移植？ 2、什么是克隆動物？,為什么用卵母細 胞做受體細胞,用MII期卵母細胞（卵母細胞進入輸卵管，并停留在第2次成熟分裂中期，此時染色體都集中在赤道板位置，容易去除染色體，而且此時的細胞才具備受精能力，更容易接收外源染色體）因為細胞質(zhì)環(huán)境適宜。重組需要的因子存在于MII期卵母細胞的胞質(zhì)中，MII期卵母細胞中成熟促進因子（MPF）活性高，能支持胚胎的全程發(fā)育，因此用作受體卵母細胞。,為什么不用動物體 細胞直接培養(yǎng)而用 核移植技術？,3、體細胞核移植技術的應用前景 4、體細胞核移植技術存在的問題,動

13、物細胞融合,動物細胞融合 1. 動物細胞融合過程,誘導,細胞膜穿通,細胞膜連接,細胞融合形成雜種細胞,細胞核,病毒顆粒,細胞核,滅活的病毒顆粒黏附在細胞表面,細胞膜被病毒顆粒穿過,細胞膜連接,動物細胞融合,細胞融合，形成雜種細胞,動物細胞融合與植物細胞雜交的基本原理是什么？,細胞融合的具體步驟是：,細胞膜的流動性,動物細胞融合相當于植物細胞雜交的原生質(zhì)體融合過程。,先進行膜穿通，再完成細胞質(zhì)融合，細胞核的融合則是在第一次有絲分裂時完成的。,誘導動物細胞融合與植物細胞雜交的方法共同點,動物細胞融合的常用方法：化學法和滅活的動 物病毒,主要用于制備單克隆抗體,獲得雜種植株,用 途,物理、化學方法,

14、（同左）,滅活的病毒,物理（離心、振蕩、電刺激）,化學（聚乙二醇）,誘導方法,使細胞分散后誘導細胞融合,去除細胞壁后誘導原生質(zhì)體融合,細胞融合的方法,細胞膜的流動性,細胞膜的流動性,細胞融合的原理,動物細胞融合,植物體細胞雜交,比較項目,比較項目,植物、動物細胞融合的比較,長期以來，為了獲得抗體，采用的是把某種抗原反復注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需抗體的方法。用這種方法獲得的抗體，不僅產(chǎn)量低，而且抗體的特異性差，純度低，反應不夠靈敏。人們發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)生免疫反應的過程中，體內(nèi)的效應B細胞可以產(chǎn)生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每個效應B細胞只分泌一種化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體。要

15、想獲得大量的單一抗體，就必須用單個效應B細胞進行無性繁殖。,（2）從動物血清中分離出的抗體有什么缺點？,（1）什么是抗體？是由什么細胞產(chǎn)生的？,（3）單克隆抗體的概念？,（4）取效應B細胞進行細胞培養(yǎng)能否獲得單克隆抗體？,什么是抗體？ 由何種細胞產(chǎn)生？ 主要分布在哪里？ 起何作用？ 什么是單 克隆抗體？,效應B細胞,血清,特異性免疫作用,抗體：機體受抗原刺激后產(chǎn)生的，并且能與該抗原發(fā)生特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。,用單個B淋巴細胞進行無性增殖（擴增），也就是通過克隆，形成細胞群，這樣的細胞群就有可能產(chǎn)生出化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體。,單克隆抗 體,討論：怎樣才能獲得單克隆抗體？,提示1

16、：僅用細胞培養(yǎng)技術可行嗎？,提示2：我們所學的哪種細胞是可以無限增殖的？,提示3：有什么方法能使B細胞產(chǎn)生抗體的能力和腫瘤細胞無限增殖能力同時具備呢？,設計方案： 一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體 小鼠骨髓瘤細胞能無限增殖,-化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體。,雜種細胞,單克隆抗 體,實驗目的:制備單克隆抗體. 實驗原理：B淋巴細胞能產(chǎn)生抗體，骨髓瘤細胞能無限增殖，雜交瘤細胞既能產(chǎn)生抗體又能無限增殖。 實驗材料：小白鼠 實驗器材：培養(yǎng)皿、針筒等等。 實驗過程：如下頁,根據(jù)阿根廷科學家米爾斯坦和德國科學家柯勒設計的實驗方案:,單克隆抗體的制備,單克隆抗體的制備過程：,骨髓瘤細胞？,選出能產(chǎn)生特定抗

17、體的細胞群、繼續(xù)培養(yǎng),體外培養(yǎng),從培養(yǎng)液中獲取,單克隆抗體制備過程,抗原？,淋巴細胞？,體內(nèi)培養(yǎng),從腹水中提取,單克隆抗體,細胞融合、篩選,雜交瘤細胞,細胞培養(yǎng),單克隆抗體制備過程,細胞融合、篩選,足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群,單克隆抗體,誘導其融合的方法有哪些？,兩次篩選分別有什么目的？,本過程利用了哪些原理？,為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？,第一次篩選得到雜交瘤細胞 第二次篩選出特異抗體的細胞群。,免疫原理、細胞融合原理、動物細胞培養(yǎng)原理,細胞的同源性越近，融合形成的雜種細胞越易成活。繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領，因而可以獲得

18、大量單克隆抗體。,動物細胞融合與單細胞克隆 1、過程：,物理法、化學法,滅活的病毒,仙臺病毒 皰疹病毒 新城雞瘟病毒,篩選,特定的選擇性培養(yǎng)基,單克隆抗體,思 考：,（1）為什么用小鼠骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合？,（1）為什么用小鼠骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合？,細胞的同源性越近，融合形成的雜種細胞越易成活。繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領，因而可以獲得大量單克隆抗體。,（）骨髓瘤細胞是癌細胞嗎？,有無限增殖能力的細胞是腫瘤細胞，而具有轉移能力的腫瘤細胞，稱為癌細胞，所以瘤細胞不能等同于癌細胞。,（）制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選？,第一次篩選得到雜交瘤

19、細胞 第二次篩選出特異抗體的細胞群。,(5) 本過程利用了哪些原理？,免疫原理、細胞融合原理、動物細胞培養(yǎng)原理,（）單克隆抗體制備過程中應用哪些細胞 工程技術手段？,細胞融合技術、細胞培養(yǎng)技術。,下圖為某同學根據(jù)雜交瘤技術的方法，設計的生產(chǎn)破傷風桿菌的實驗方案,制備單克隆抗體,效應B細胞,抗體,細胞融合,滅活病毒,雙親細胞,分泌抗體,無限增殖,原代,傳代,50,如何篩選出雜交瘤細胞？,（1）淋巴細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能夠被氨基蝶呤阻斷。一般不分裂增殖。 （2）骨髓瘤細胞是特殊選擇的代謝缺陷型細胞，其DNA合成過程只具有D途徑，能被氨基蝶呤阻斷。 （3）雜交瘤細胞則即可無限增

20、殖，又具備兩條DNA合成途徑。,加入了氨基嘌呤的選擇培養(yǎng)基,第一次篩選,第二次篩選,HAT培養(yǎng)液 細胞合成DNA有兩條途徑： 一為主要途徑，利用糖和氨基酸合成核苷酸，可被氨基蝶呤阻斷； 二為補救途徑，通過磷酸核糖轉化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷合成核苷酸。 骨髓瘤細胞缺乏HGPRT和TK（無補救途徑）； B細胞具有HGPRT（有補救途徑），但在體外不能長期培養(yǎng)，自然死亡； 雜交瘤細胞從B細胞獲得HGPRT或TK基因在HAT培養(yǎng)基上生長繁殖。,整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?,第一次篩選得到雜交瘤細胞（多種）。 第二次需先在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一個雜交

21、瘤細胞的情況下開始培養(yǎng)，然后再篩選出繼承了雙親遺傳物質(zhì)的雜交瘤細胞，即不僅具有效應B細胞分泌抗體的能力，而且還具有無限增殖的本領，因而可以獲得大量單克隆抗體。 由于該細胞群是單個雜交瘤細胞克隆得來的，所以產(chǎn)生的抗體必然是化學性質(zhì)單一的特異性強的單克隆抗體。這里的單克隆確有單個細胞克隆的含義，只不過克隆的不是B淋巴細胞，而是雜交瘤細胞。,酶解法去壁,纖維素酶,果膠酶,物理法,聚乙二醇(PEG),離心 振動 電刺激,化學法,滅活的病毒,生物法,去壁方法,人工誘導融合的方法,條件,培養(yǎng)基,原理,動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液,細胞增殖（有絲分裂）,單細胞克隆,思考題,1、植物組織培養(yǎng)過程將組織分散成單個細胞的

22、嗎？,、動物細胞培養(yǎng)過程將組織分散成單個細胞的嗎？,、為何動物細胞培養(yǎng)過程將組織分散成單個細胞的呢？,、如何將動物組織分散成單個的細胞呢？,、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可說明細胞間的物質(zhì)是什么成份？,沒有,是,成塊的組織細胞靠在一起,彼此限制了細胞的生長和增殖,先用剪刀剪碎,后用蛋白酶處理,胰蛋白酶水解蛋白質(zhì),細胞間的成份是蛋白質(zhì),思考題,、細胞膜的主要成份是什么？,、胰蛋白酶能將細胞消化掉嗎？,、既然胰蛋白酶能將細胞消化掉，那將動物組織分散成單個細胞要注意什么問題呢？,、能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？,10、動物細胞培養(yǎng)取材時，一般是取胚胎組織或幼齡動物的組織或器官，請解釋原因？,

23、蛋白質(zhì)和磷脂,能,注意時間的控制,不能，因為兩的最適PH不同，而正常組織細胞的生存環(huán)境與胰蛋白酶的最適PH較接近,胚胎組織或幼齡動物的組織或器官分裂、增殖旺盛,思考題,11、動物細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面為何要光滑、無毒？,12、培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)到什么時候就不再分裂、增殖？,13、如此時細胞數(shù)量并未達到人們的需求，應該怎樣辦？,易于培養(yǎng)細胞貼壁，進行生長增殖,當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞分裂就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象叫接觸抑制。,將貼滿細胞壁的細胞用胰蛋白酶處理，然后繼續(xù)增殖。,這樣的過程叫做傳代培養(yǎng),思考題,14、如何理解原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？,15、傳代培養(yǎng)的細胞能一直傳代下去嗎？,16

24、、有些為何能一直傳下去嗎？,17、動物細胞培養(yǎng)就是為了得到這些細胞嗎？,18、人類一般保存的是哪類細胞呢？為什么？,上述過程中，在第一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是原代培養(yǎng)，之后轉移到其它培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是傳代培養(yǎng),不都能,發(fā)生突變，朝著癌細胞方向發(fā)展,不是,保存10代以內(nèi)的細胞，因為1050部分細胞的細胞核型可能發(fā)生變化，有少部分還發(fā)生突變向癌細胞方向發(fā)展,單克隆抗體的應用,作為診斷試劑 用于治療疾病和運載藥物 （制成“生物導彈”）,優(yōu)點是什么？,單克隆抗體的應用,1、用于臨床診斷（利用抗體與抗原的特異性結合）,2、形成“生物導彈”治療腫瘤,目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的

25、傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。,單克隆抗體作為載體分子，同抗癌藥物相結合，將他們運載到腫瘤部位，殺死癌細胞，這種抗體藥物結合物稱之為生物導彈。它能定向殺滅癌細胞，避免或減少對正常細胞的傷害，大大減輕了抗癌藥物的副作用。,細胞工程,應用的原理和方法,細胞生物學和分子生物學,細胞整體水平或細胞器水平,按照人們的意愿來改變細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細胞產(chǎn)品,概念,分類,植物細胞工程,理論基礎,細胞的全能性,研究的目的,研究的水平,動

26、物細胞工程,技術分類,細胞融合技術、細胞拆合技術、染色體導入技術、基因轉移技術、胚胎移植技術、細胞與組織培養(yǎng)技術,盡管克隆技術有著廣泛的應用前景，但離產(chǎn)業(yè)化尚有很大距離。因為作為一個新興的研究領域，克隆技術在理論和技術上都還很不成熟。,資料1：克隆技術存在的問題,在理論上，分化的體細胞克隆對遺傳物質(zhì)重編（細胞核內(nèi)所有或大部分基因關閉，細胞重新恢復全能性的過程）的機理還不清楚；克隆動物是否會記住供體細胞的年齡，克隆動物的連續(xù)后代是否會累積突變基因，以及在克隆過程中細胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。,在實踐中，技術尚不成熟，得到的克隆動物具有極大的偶然性和隨機性。迄今為止，克隆試驗的成功

27、率始終很低。例如在培育“多莉“的實驗中，融合了277枚移植核的卵細胞，僅獲得了 “多莉”這一只成活羔羊，成功率只有0.36，同時進行的胎兒成纖維細胞和胚胎細胞的克隆實驗的成功率也分別只有1.7和1.1。目前，多莉羊的制備還不能重復，更不能肯定克隆多莉羊的方法也適用于其它動物或其它不同組織器官的細胞?？寺游镓舱勐矢?，不少克隆動物天生患有疾病或體形過大。克隆動物沒有遺傳物質(zhì)的交流和互補，將會加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。,資料2：珍稀動物的克隆繁殖,中國克隆大熊貓技術的三個關鍵問題，包括異種核質(zhì)相容、囊胚著床和克隆個體三個階段，前兩個階段的實驗現(xiàn)已成功?？寺〈笮茇埖年P鍵問題則是第三步，即大熊貓的胚胎能

28、否在家貓或其他寄母的子宮中形成個體，研究小組爭取在今年年底取得突破性進展。,動物難以克隆的根本原因：,基因表達的調(diào)控使得細胞中合成了專一的蛋白質(zhì)。,一類基因是維持生存的；另一類基因隨著組織器官和發(fā)育階段不同而選擇性表達。,如：哺乳動物的紅細胞只 有少量的線粒體。,（3）完成胚胎發(fā)育的必要的環(huán)境條件。,（1）具有包含物種完整基因組的細胞核的活細胞；,（2）能有調(diào)控細胞核發(fā)育的細胞質(zhì)物質(zhì)；,克隆所要的實際條件：,克隆所要的理論條件：,細胞的全能性。,四、其它生物工程技術,（一）胚胎移植技術（試管嬰兒）,實踐意義： (1)提高良種母畜的繁殖力；(2)使母畜一次生胎；(3)進行胚胎性別選擇；(4)減少

29、精液消耗；(5)凍存良種胚胎；(6)試管嬰兒：可以解除人的某些不孕癥。,（二）胚胎分割移植技術,代孕母牛,1、過程,早期胚胎,胚胎 移植,母體子宮,發(fā)育,多個幼體,2、特點,屬于無性生殖，后代具備一個親本的遺傳物質(zhì),3、應用,加快優(yōu)良種畜的繁殖速度等,切割,多個細胞,早期胚胎,利用胚胎干細胞具有全能性的特點,細胞拆合技術：也稱為細胞核（包括細胞器）移植技術。 是將細胞核和細胞質(zhì)用某種方法拆開，然后再把分離的不同細胞的細胞核（細胞器）和胞質(zhì)體重新組合成一個新細胞。,胚胎移植技術,電脈沖刺激，動物細胞培養(yǎng)技術,2、克隆羊多莉有幾個母親？,3、多莉羊是雄還是雌？主要性狀像誰？,4、其性狀遺傳是否符合

30、孟德爾遺傳規(guī)律？,（三）核移植技術-克隆,1.核移植技術涉及到幾種生物技術？,例：下列關于細胞工程的敘述中，錯誤的是 A植物細胞融合必須先制備原生質(zhì)體 B試管嬰兒技術包括人工受精和胚胎移植兩方面 C經(jīng)細胞核移植培育出的新個體只具有一個親本的遺傳性狀 D用于培養(yǎng)的植物器官或組織屬于外植體,失分陷阱 沒有認識到生物的遺傳中核遺傳和質(zhì)遺傳共同作用的結果，同時對各種細胞工程的具體過程不了解，對有關的術語不理解，都是失分主要原因。,多莉羊誕生的意義： 已經(jīng)分化的動物體細胞核，仍然具有全能性，在合適的條件下，就可以發(fā)育成新的個體。,克隆的意義與應用,1.加速家畜遺傳改良進程，促進優(yōu)良畜群繁育,體細胞核移植

31、技術的應用前景,優(yōu)良家畜體細胞核,2.保 護 瀕 危 物 種,去核卵 母細胞,核移植重構胚,細胞核,瀕危動物細胞核,3.異 種 器 官 移 植,可移植器官短缺,克隆過程,4.生 產(chǎn) 藥 用 蛋 白,克隆過程,5.培 育 各 種 疾 病 動 物 模 型,應用核移植技術可以培育基因完全一致的實驗動物模型 ，為遺傳學，病理學研究提供良好的實驗材料。,1、核移植成功率低,2、克隆動物異常 胎兒或新生兒死亡率極高（死亡率90%死亡）。 余下的10%中的一半不能活到成年。 極少數(shù)能全程發(fā)育的個體也表現(xiàn)為超重、呼吸系統(tǒng)疾病等異常表型。 個別表型正常者也存在有免疫缺陷、關節(jié)炎或腎、腦畸形等問題,導致克隆動物后

32、期死亡。,目前存在的問題,據(jù)新科學家雜志8月3日報道，韓國著名的克隆專家Woo Suk Hwang一手培育出世界首只克隆犬阿富汗獵犬，自克隆羊多利誕生之后，公眾有興又見到一條由克隆技術培育存活下來的獵犬。 Hwang的研究小組共采集了1095個母阿富汗獵犬的卵細胞，并將其放入一條公阿富汗獵犬體細胞核進行核移植，然后把他們放置在123個受孕母獵犬的體內(nèi)。在這么多受孕母獵犬中，只有三個最終成功受孕。其中有一個流產(chǎn)，最后只有兩個成功到分娩期。其中一個分娩成功的小獵犬在出生22天的時候死于肺炎。,五、需要歸納總結的幾個問題,1.克隆技術及種類,是指從一個共同的祖先，通過無性繁殖的方法產(chǎn)生出來的一群遺傳

33、特性相同的DNA分子、細胞或個體，是一種人工誘導的無性繁殖方式。,個體水平克?。嚎寺⊙蚨嗬?分子水平克隆：PCR技術,細胞水平克?。簞游锛毎囵B(yǎng)（單克隆體）,分子水平克?。≒CR技術）：DNA的復制；RNA的復制；同一基因的多次表達等。,細胞水平克?。簞游锛毎囵B(yǎng)（單克隆體）；愈傷組織的不斷增殖等。,個體水平克隆：克隆羊多利。,2.培養(yǎng)基的異同點,3.對細胞處理的總結,解離液：破壞細胞間質(zhì)，殺死細胞并使細胞分離，用于有絲 分裂實驗。 纖維素酶和果膠酶：用于制備活的原生質(zhì)體進行植物細胞雜交。 胰蛋白酶：水解動物組織細胞間隙中含有的彈性纖維等蛋白質(zhì)，使動物組織細胞彼此分離，用于動物細胞培養(yǎng)。 Ca

34、Cl2溶液：增加受體微生物細胞壁的通透性，用于基因工程中目的基因的導入。,4.三項生物工程技術的比較,5.動物細胞培養(yǎng)、植物細胞培養(yǎng)的比較,6.植物體細胞雜交與動物細胞融合的比較,克隆技術的發(fā)展,1、微生物克隆,2、遺傳工程克隆,3、個體水平上的克隆,.20世紀50年代，美國 兩棲動物的魚類細胞核移植技術。,.20世紀80年代以來，世界各國 應用胚胎細胞克隆技術，克隆出羊、牛、 鼠、兔、猴等動物。,.1997年蘇格蘭羅斯林研究所 完成首例體細胞克隆動物克隆羊“多利”,我國的克隆技術也毫不遜色。60年代，生物學家童第周對金魚、鯽魚進行細胞核移植，1978年又成功地進行了黑斑蛙的克隆試驗，他將黑斑蛙的紅細胞的核移入事先除去了核的黑斑蛙卵中，這種換核卵最后長成能在水中自由游泳的蝌蚪。 1979年春，中國科學院武漢水生生物研究所的科學家克隆了魚。,小資料1,1990年5月，西北農(nóng)業(yè)大學畜牧所克隆一只山羊。1992年，江蘇農(nóng)科院克隆一只兔子。1993年，中科院發(fā)育生物學研究所與揚州大學農(nóng)學院合作，克隆一只山羊。1995年7