1、分子量及分子式的測定 質譜分析測定分子量和分子式。 苷類化合物一般極性較大，無揮發(fā)性，遇熱氣化時易于分解，采用電子轟擊質譜(EIMS)常常不能獲得分子離子峰。 現(xiàn)多采用化學電離質譜(CI-MS)、場解吸質譜(FD-MS)、快原子轟擊質譜(FAB-MS)和電噴霧質譜(ESI-MS)等方法來獲得分子離子蜂，尤其是ESI-MS及FAB-MS兩種質譜法更是目前測定苷類分子量常用的方法。,七、糖鏈結構的測定,組成苷的苷元和單糖的鑒定 將苷用稀酸或酶進行水解，使生成苷元和各種單糖 苷元的結構鑒定 在有關章節(jié)中逐一介紹。 組成苷中糖的種類鑒定 通常采用PC、TLC等方法對水解液進行鑒定。 糖類的PC常用的展

2、開劑大多為含水的溶劑系統(tǒng)，如正丁醇-醋酸-水(4:1:5)，EtOAc-吡啶-水(2:1:2)等，其Rf值與溶劑的含水量有關。,七、糖鏈結構的測定,苷中糖的數目的測定 質譜：苷分子量-苷元分子量，求出糖的數目。 核磁：氫譜中端基質子信號數(5ppm左右)，碳譜中端基碳信號的數目(90-112ppm)。,七、結構的測定,苷元和糖之間連接位置的確定 13C-NMR：苷化位移規(guī)律，將苷和苷元的碳譜相比較。 成苷后，-C約+8ppm,-C約-4ppm 二維核磁共振譜(如HMQC COSY及HMBC譜)等技術廣泛用于確定連糖位置。,七、結構的測定,糖與糖的連接位置的確定 全甲基化物進行甲醇解，分析其甲醇

3、解產物。,七、糖鏈結構的測定,采用的方法通常是將這些甲醚化的單糖進行了TLC鑒定，并與標準品對照。近來亦有用GC-MS聯(lián)用儀對其進行鑒定的報道。 全甲基化甲醇解：,七、糖鏈結構的測定,七、糖鏈結構的測定,如：已知某二糖甲醇解后得到下列產物， 請推測該二糖的結構（連接位置）,全甲基化甲醇解,甲基化反應 (1)Haworth法：用硫酸二甲酯和氫氧化鈉(或碳酸鈉、碳酸鉀)，可使醇羥基甲基化。其缺點是甲基化能力較弱，如果欲進行全甲基化反應，必須進行多次反應才能達到目的， (2)Purdie法：用碘甲烷和氧化銀為試劑(一般可在丙酮或四氫呋喃中進行)，可使醇羥基甲基化，但因氧化銀具有氧化作用，只能用于苷的

4、甲基化而不能用于還原糖的甲基化。,七、糖鏈結構的測定,(3)Kuhn改良法：在二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入碘甲烷和氧化銀或硫酸二甲酯及氫氧比鋇(或氧化鋇)，在攪拌下進行甲基化。本法的缺點是反應較緩慢。 (4) Hakomari法(箱守法)：二甲基亞砜(DMSO)，氫化鈉，碘甲烷,七、糖鏈結構的測定,此法反應迅速、完全、無需特殊裝置、可在室溫下連續(xù)反應，是目前最常用的全甲基化方法。但因在反應中，所用二甲亞砜和NaH均呈強堿性，故分子中有酯鍵的苷類不宜用本法。,七、糖鏈結構的測定,酶水解 轉化糖酶-水解-果糖苷鍵 麥芽糖酶-水解-葡萄糖苷鍵 杏仁苷酶-水解-葡萄糖苷鍵,專屬性較低 纖維素酶-

5、水解-葡萄糖苷鍵 NMR譜法測定 利用端基質子的偶合常數 如：5ppm(1H, d, J=7Hz)為下面哪個結構？,七、糖鏈結構的測定-苷鍵構型的確定,一 、提取 植物體內，苷類常與水解該苷的酶共存。 提原生苷：先殺酶。 常用的方法是在中藥中加入CaCO3,或用甲醇、乙醇或沸水提取，同時提取過程中要盡量勿與酸或堿接觸，以免苷類分解。 提苷原：可利用酶活性,八、糖及苷類的提取和分離,八、糖及苷類的提取和分離 化合物的極性,功能基的種類：(-COOH) (-OH) (C=O) (-COOR) -O- (-CnHm) 極性功能個數 分子內氫鍵降低極性 化合物大小 小分子的極性大于大分子的極性,常用溶

6、劑極性： 水 甲醇 乙醇 丙酮 乙酸乙酯 氯仿 乙醚 己烷 H2OMeOHEtOHCH3COCH3 EtOAcCHCl3EtOEtCH3(CH2)4CH3,流程圖,八、苷類的提取和分離,糖和苷的提取分離,藥材,水,水提液,3倍量以上乙醇,醇水溶液,沉淀,（苷）,（多糖）,多糖提取分離（一）提取 水提得到的粗多糖水溶液，加入95%乙醇使含醇量達80%，4攝氏度靜置過夜，多糖析出。減壓抽濾，用95%乙醇洗至溶液無色。沉淀（多糖）揮干醇。（二）除蛋白 這是至關重要的一步，由于蛋白是大分子，它的存在會干擾多糖的純化。一般選用sevage法萃取或離心，多糖濃度為1mg/ml, 氯仿-正丁醇比例通常在3:

7、1-5:1之間，變性的蛋白質一般在兩相交界處產生一條白色的帶。（三）檢測 除蛋白前后用紫外分光光度計檢測280nm（蛋白質）和260nm（核酸）下的吸收值，多糖濃度為0.4mg/ml對照驗證除蛋白的效果。,(四)離子交換纖維素(DEAE-纖維素)進行初步分離 一般選用DE-52型離子交換纖維素（二乙氨基乙基纖維素52）柱的預處理 加蒸餾水浸泡過夜，期間換幾次水，每次除去細小顆粒，用0.5mol/LHCl溶液浸泡12h, 蒸餾水漂洗至中性；再用0.5mol/LNaOH溶液浸泡12h, 蒸餾水漂洗至中性。洗脫 樣品濃度在20mg/ml左右。先用水洗脫，再用NaCl梯度洗脫，小試時的梯度應密集一些，0.05, 0.1, 0.3, 0.5mol/L洗脫，每瓶8ml, 10min左右一瓶即可。根據紫外檢測的結果，再進行梯度的修改。合并流分 硫酸-蒽酮法結合紫外檢測,（1）硫酸-蒽酮試劑的配制稱取0. 1g蒽酮至容量瓶中，加少量濃硫酸，攪拌使其溶解，加濃硫酸至50ml搖勻，得0.2%的硫酸-蒽酮試劑，盡量現(xiàn)配先用。（2）方法餾分隔管檢測，每管取0.5ml，在冰浴中加入2ml硫酸-蒽酮試劑，然后在沸水中煮1015min, 自來水冷卻，放至室