1、Exercise one,顯微鏡的使用和細(xì)菌的簡單染色,制作者：黃海嬋（） Telor顯微鏡介紹,油鏡的使用原理,染色原理,目的要求,實驗原理,實驗材料,實驗程序,作業(yè),顯微鏡的使用,細(xì)菌簡單染色的流程,實驗原理顯微鏡介紹,普通光學(xué)顯微鏡(NIKON) 歐林巴斯（OLYMPUS）生物顯微鏡 麥克奧林生物顯微鏡,顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率,1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)接目鏡放大倍數(shù) 2. 顯微鏡的分辨率 是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點之間距離的能力，可用公式表示為： D=/2nsin(/2 ) 式中D：物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。

2、：可見光的波長（平均0.55m) n: 物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。 ：鏡口角（即入射角）。,實驗原理油鏡使用的原理,油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。,油浸沒物鏡 介質(zhì)：左空氣；右香柏油,實驗原理染色劑和染色原理,回目錄頁,由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一般在80-90%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運動性和直接計算菌

3、數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但是，任何一項技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實情況，染色觀察時必須注意。 微生物染色的基本原理，是借助物理和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。 化學(xué)因素如：正負(fù)離子之間的相互吸引等。,實驗原理染色劑和染色原理,染色劑 染料按其電離后所帶電荷的性質(zhì)可分為以下類型： 1. 酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。 2. 堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲

4、基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。 3. 中性（復(fù)合）染料：如伊紅、美蘭等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于細(xì)胞核染色）。 4. 單純?nèi)旧哼@類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（Sudan b)的染料。,細(xì)菌的等電點較低，pH值大約在25之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時染料離子帶陽電。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。,實驗原理染色劑和染色原理,微生物染色常用染料如下表：,實驗原理細(xì)菌的三種基本形態(tài),球菌（Spherical coccus）:包括雙球

5、菌、鏈球菌、葡萄球菌、四鏈球菌、八疊球菌等,桿菌(Rod-shaped bacillus)：短小、粗大、細(xì)長、棒狀、分支,螺旋菌(Spired-shaped spirallum)：弧菌、螺菌,實驗材料,器材：顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙、載波片、蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈、廢液缸、洗瓶等。 細(xì)菌形態(tài)的染色標(biāo)本。 菌種：培養(yǎng)1218h的枯草桿菌（B.subtilis)、 大腸桿菌（E.coli）、 金黃色葡萄球菌（S.aureus） 染色液和試劑：石炭酸復(fù)紅、呂氏美藍(lán)、香柏油、二甲苯(或者乙醇乙醚溶液）等-,實驗程序顯微鏡的使用,1.用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。 2.調(diào)節(jié)光亮度 3.低倍鏡觀察：

6、粗調(diào)、細(xì)調(diào) 4.依次再進(jìn)行中倍、高倍觀察 5.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。 6.換片：另換新片，必須從第三條開始操作。 7.用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯（或者乙醇乙醚溶液）擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。,主要是油鏡的使用,顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項：,1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。 2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度，用完油鏡必須進(jìn)行“三擦”。 3.觀察標(biāo)本時，必須依次用低、中、高倍鏡

7、，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。 4.觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時，右眼注視繪圖。 5.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。 6.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。,實驗程序細(xì)菌簡單染色,蒸餾水,涂片,接種環(huán),自然干燥,固定,石炭酸復(fù)紅(呂式美蘭),染色1min,水洗,干燥,擦拭,水洗時不要直接沖菌膜,每位學(xué)生一人一組，取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，各做一塊涂片。,錄像演示,染色注意事項,1.涂片過程中，去生理鹽水和細(xì)菌不宜過多，涂菌

8、要均勻，不宜過厚。,2.固定時溫度不可過高，以載玻片背面不燙手背為宜，因為溫度過高會破壞細(xì)胞的形態(tài)。,3.水洗時，不應(yīng)直接沖洗細(xì)菌涂面，水流不應(yīng)過大、過急，以免細(xì)菌涂面被沖掉。,錯誤操作示范,實驗報告,根據(jù)觀察結(jié)果，畫出大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態(tài)圖，并注明菌體染色后的顏色。,思考題,油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什么？ 使用油鏡時，為什么必須用鏡頭油？ 鏡檢標(biāo)本時，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？,實 驗 一,結(jié) 束,下周實驗,實驗二 細(xì)菌的革蘭氏染色和芽孢染色 （書中實驗十一和實驗十四）,球菌,肺炎鏈球菌,淋球菌,化膿性鏈球菌,金黃色葡萄球菌 Staphylococcus