1、1,時間分辨熒光免疫技術(shù),2,問 題,什么是時間分辨熒光免疫分析（TrFIA ）？ TrFIA的標(biāo)記物及特點。 為什么叫“時間分辨”? TrFIA的檢測原理 各種免疫方法學(xué)的比較 TrFIA的 臨床應(yīng)用,3,時間分辨熒光免疫 （TrFIA）（Time-Resoled Fluoroimmunoassay）,4,定 義,TrFIA分析法是用三價稀土離子及其螯合劑作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素或酶，標(biāo)記蛋白質(zhì)、多胎、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，當(dāng)反應(yīng)體系發(fā)生后，用TRF儀器測定最后產(chǎn)物中熒光強度。根據(jù)熒光強度或相對熒光強度比值，來判斷反應(yīng)體系被分析物的濃度，達(dá)到定量分析之目的。,5,發(fā)展歷

2、程,1979年，芬蘭SOINI和HEMMIA 提出“時間分辨熒光免疫分析”理論 1983年SOINI和KOJOLA 提出以鑭系元素標(biāo)記為示蹤螯合物和時間分辨熒光測量相結(jié)合，建立一種新的非放射性微量分析技術(shù) 現(xiàn)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗中一項最有發(fā)展前景的分析手段。,6,廠 家,芬蘭的WALLAC和加拿大一家公司，但加拿大使用激光，主要在科研 WALLAC和新波公司使用疝燈，主要用于臨床,7,標(biāo)記物為具有獨特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?鑭系元素,鑭系元素共有15種，屬三價元素，應(yīng)用在時間分辨熒光免疫技術(shù)中有四種： 銪(Eu)、釤Sm)、鏑(Dy)、鋱(Te) Eu3 +的應(yīng)用最為廣泛， S

3、m3+ 可作為第二種選擇以進(jìn)行雙標(biāo)記或多標(biāo)記技術(shù) 不同的三價稀土離子具有不同發(fā)射光譜和各自不同的熒光壽命等特點，這樣就適合進(jìn)行雙標(biāo)記和多標(biāo)記，從而實現(xiàn)可同時檢測一個樣品中，兩種或兩種以上的抗原或抗體，即一個試劑盒相當(dāng)與兩個試劑盒或多個試劑盒，這就是我們所說的多標(biāo)記技術(shù)。,8,鑭系元素?zé)晒馓攸c： 熒光壽命極長 鑭系元素螯合物（60900 us) 普通熒光免疫中熒光團：1100ns 樣本中蛋白質(zhì)熒光：110ns，易猝滅。 Stokes位移大 銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm， 熒光素的Stokes位移近280nm 熒光特異性強。（發(fā)射光譜帶很窄：615 5nm） 解離-增強技術(shù)可使其熒光性提

4、高100萬倍,9,時間分辨,生物制品（如蛋白質(zhì)）本身產(chǎn)生的熒光波長位于400-600nm，所以用普通熒光素來檢測生物樣品時，自然本底的熒光干擾太大。 樣品中蛋白質(zhì)類的本底熒光衰變時間約為1-10ns TrFIA技術(shù)中，由于鑭系稀土離子螯合物所產(chǎn)生的熒光不僅強度高，而且半壽期也長，介于10-1000us之間，比普通熒光標(biāo)記物高5-6個數(shù)量級（1000ns=1us)。 含有銪或釤的螯合物的熒光衰變時間分別為730000ns和50000 ns。因此利用延緩測量時間，待測樣品中短壽命的自然熒光完全衰變后，再檢測稀土離子螯合物的熒光信號（見圖1）。消除了來自樣品、試劑及其他非特異熒光，從而達(dá)到降低自然本

5、底熒光和消除樣品熒光的干擾，大大提高了檢測靈敏讀。這既是我們長提到的時間分辨。,10,通過時間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光 分辨開來，使本底達(dá)到0,利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦?，熒光激發(fā)后在固定時間段檢測特異性熒光。而在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減為0,圖1,11,Stokes位移,Stokes位移：是指激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的光譜波峰的波長差。 例如TRF中銪的激發(fā)光波長340nm,發(fā)射光波長613nm，兩者之間的波長差即Stokes位移為273nm（見圖2），所以激發(fā)光和發(fā)射光很容易用干涉濾光片分開。 而普通熒光物質(zhì)的激發(fā)光與發(fā)射光之間的波長差即Stokes位移為28nm，那就很難排

6、除激發(fā)光對發(fā)射光的干擾，影響檢測結(jié)果。,12,利用鑭系元素光譜特點，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的又一保障,發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大Stokes位移?？梢酝ㄟ^干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。,圖2,13,稀土離子激發(fā)光、發(fā)射光和Stokes位移,14,解離增強技術(shù),解離增強技術(shù)是TRF技術(shù)中所特有的 指當(dāng)免疫反應(yīng)完成后部分標(biāo)記物結(jié)合到固相載體上，未結(jié)合的標(biāo)記物被洗掉。 再加入低PH值（PH23）的增強液，把Eu或Sm從免疫復(fù)合物中解離下來，與增強液中的螯合物質(zhì)（-二酮體）結(jié)合形成新的螯合物，使標(biāo)記物產(chǎn)生的熒光強度增強近百萬倍,15,時間分辨熒光免疫的原理,用三價稀土離子及

7、其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗原、抗體、核酸探針等物質(zhì)； 當(dāng)免疫過程結(jié)束后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的物理特點 （特異性強、 Stokes位移大、 壽命長），并采用解離-增強技術(shù)（ DELFIA）放大有效熒光；最后用時間分辨熒光分析儀，測定免疫反應(yīng)最后產(chǎn)物的熒光強度。 根據(jù)已知濃度所確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，來判斷未知樣品的濃度值，以達(dá)到定量分析的目的。,16,時間分辨熒光免疫原理圖（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）,17,乙肝“兩對半” TRFIA定量檢測原理示意圖,18,乙肝表面抗原免疫反應(yīng)圖 （時間分辨熒光法）,

8、19,乙肝表面抗體免疫反應(yīng)圖 （時間分辨熒光法）,20,乙肝抗原免疫反應(yīng)圖 （時間分辨熒光法）,21,乙肝抗體免疫反應(yīng)圖（時間分辨熒光法）,22,乙肝核心抗體免疫反應(yīng)圖 （時間分辨熒光法）,23,時間分辨熒光免疫的試劑種類,甲狀腺功能檢測 TSH，Ultra TSH，T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TBG，TG 性激素類檢測 FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG 腫瘤標(biāo)記檢測 AFP，CEA，PSA，hTG，-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSA EQM，CA-50，CA-125，CA-199 遺傳科檢查 產(chǎn)前篩查：

9、hAFP/ HCG ，PAPPA 新生兒篩查：Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OH Prog，PKU 傳染病檢測 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 血液科檢測 貧血檢查：Ferritin，Vit B12，F(xiàn)olic acid 科研工具 單標(biāo)記檢測，雙標(biāo)記檢測，三標(biāo)記檢測，四標(biāo)記檢測,24,時間分辨熒光免疫分析與其它免疫學(xué)方法的比較,25,標(biāo)記免疫學(xué)發(fā)展歷程,酶聯(lián)免疫（精度：10-9 mol/L ） 放射免疫（精度：10-12mol/L ） 化學(xué)發(fā)光 （精度：10-15mol/L ） 電化學(xué)發(fā)光（精度：10-17mol/L ） 時間分辨熒光

10、（精度：10-18mol/L ） 生物芯片 （未知）,酶免疫技術(shù) 熒光抗體技術(shù) 三大標(biāo)記技術(shù) 放射免疫分析,26,待測物質(zhì)濃度與檢測手段,臨床化學(xué)分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs (藥物濃度),Thyroid Hormone (甲狀腺激素),Fertility Hormone (孕激素),Cancer Markers (腫瘤標(biāo)記物),Infectious Disease (傳染病),Vitamins (維生素),Serum Proteins (血清蛋白),10-12,10-9,10-6,10-3,10-0,27,各種免疫

11、方法學(xué)的比較,28,放射性免疫分析法（RIA）-標(biāo)記物： 125I,應(yīng)用 放免自60年代問世以來對臨床診斷起了革命性的貢獻(xiàn)，是一項較為成熟的診斷技術(shù)。 夾心法、競爭法的標(biāo)記原理為以后的檢測技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。,缺點 放射性（125I），對環(huán)境的污染及對身體的危害，已經(jīng)為重視環(huán)保的國家逐步取消。（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室） 125I的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短。 標(biāo)記物125I的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大；標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期短，必須每次定標(biāo)，造成浪費。 操作繁瑣，出報告時間長。 無法保存?zhèn)溆谩?29,酶免疫分析法（ELISA ） -標(biāo)記物：HRP(辣根過氧化物酶）,應(yīng)用 酶免

12、的最大優(yōu)勢在于避免了對環(huán)境和人體危害。 試劑有效期較長。 衍生技術(shù)： 熒光酶免疫分析 增強化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù) 磁酶免分析 曾經(jīng)一度被認(rèn)為是取代放免的檢測手段。,缺點 靈敏度、重復(fù)性不及放免，易造成漏檢和假陽性。 因酶的純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性不好。,30,化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA） -標(biāo)記物： 化學(xué)發(fā)光物質(zhì)（魯米諾）,應(yīng) 用 單個樣本檢測速度快，適合做急診。 靈敏度較高。 自動化程度高。 儀器種類： 拜耳 ACS180 系列 雅培 AXSYM 貝克曼 ACCESS 德普 IMMULITE,缺 點 樣品不能重復(fù)檢測；出現(xiàn)故障則整批試劑及血樣報廢。 本底較高，易受環(huán)境物質(zhì)干

13、擾。 儀器故障率較高。 標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性較差，需多次定標(biāo)。 檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷方面能力不足。 非開放性試劑；試劑價格高。,31,電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECL） -標(biāo)記物：三聯(lián)吡啶釕,應(yīng)用 80年代末期問世的新型化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。 基本原理：根據(jù)三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)3和三丙胺在電場觸發(fā)下產(chǎn)生發(fā)光的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。 本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。,缺點 儀器檢測速度慢 （羅氏公司） ECL1010 60 測試/小時 ECL2010 90 測試/小時 非開放性試劑系統(tǒng)、不能做科研。 試劑價格過高。,32,TRFIA在乙肝“兩對半”定量檢測應(yīng)用,33,一、提高了檢測的靈敏度

14、時間分辨熒光法（TRFIA）檢測HBsAg靈敏度可達(dá)到0.2ng/ml，而酶免法（ELISA）檢測HBsAg靈敏度是2ng/ml。 縮短了急性乙肝檢測的“窗口期”,二、動態(tài)觀察療效和病情檢測 疾病的發(fā)生、發(fā)展、療效、預(yù)后是個動態(tài)的變化過程，TRFIA定量檢測乙肝“兩對半”各項標(biāo)志物的濃度變化可對乙肝的病程、治療、預(yù)后起到動態(tài)檢測的作用，指導(dǎo)醫(yī)生治療。,34,（1）定量分析HBsAg和HBsAb濃度的變化，可以預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期 如HBsAg濃度降低，HBsAb逐漸升高，說明病情正向恢復(fù)期發(fā)展反之。反之，HBsAg濃度處于高水平或上升，而HBsAb處于低水平，則容易發(fā)展為慢性乙肝或攜帶者

15、。,（2）定量分析HBeAg和HBeAb的濃度變化，可以反映病情變化和治療效果。 1、HBeAg向HBeAb轉(zhuǎn)換時期，即表現(xiàn)為HBeAg濃度下降和HBeAb濃度升高。 2、高濃度的HBeAg提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài)，有較強傳染性。 3、高濃度的HBeAb一方面提示病情的好轉(zhuǎn)，但在有些時候（如肝功能指標(biāo)很差）可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)。,35,（3）HBcAb濃度的高低可以反映病毒感染的狀態(tài) 1、乙肝急性感染常為高滴度的HBcAb，恢復(fù)期濃度下降，慢性乙肝HBcAb呈持續(xù)高濃度。 2、低濃度的HBcAb一般為恢復(fù)期或既往感染。,（4）有利于對慢性肝炎活動性和非活動性的判斷,非活動性慢性乙肝各項

16、指標(biāo)相對穩(wěn)定 活動性慢性乙肝往往呈進(jìn)行性變化,36,三、乙肝疫苗接種 HBsAb是一種真正意義的保護性抗體，其定量的檢測可以對其具有的免疫力做出正確的評價，對乙肝的預(yù)防起到監(jiān)督作用。,37,由此可見定量測定對乙肝疫苗免疫力的評估和高危人群預(yù)防免疫具有重要意義，特別是在少年兒童預(yù)防乙肝方面,38,四、HBV血清學(xué)標(biāo)志物與HBV-DNA的關(guān)系 血清學(xué)標(biāo)志物 反映機體對病毒的免疫狀態(tài)，病程，判斷病情， 不能完全反映病毒在體內(nèi)的復(fù)制狀況 HBV-DNA 1、真實反映病毒在體內(nèi)復(fù)制水平，觀察藥物療效 2、部分“小三陽”及低水平病毒復(fù)制時出現(xiàn)陰性 3、不能反映機體的免疫狀態(tài)和病情,39,血清HBV-DNA熒光定量PCR測定可以直接反映病毒的數(shù)量，病毒的復(fù)制情況，具有很多臨床應(yīng)用價值，但不能完全反映病毒復(fù)制靜息期肝細(xì)胞內(nèi)HBV病毒的狀態(tài),HBV-DNA陰性并不完全代表體內(nèi)HBV已被清除，結(jié)合“兩對半”各項指標(biāo)更能客觀反映體內(nèi)HBV病毒狀態(tài)，正確的判斷預(yù)后和治療,40,時間分