1、無菌檢驗及控制,王旭 2009,教程目的,GMP檢查中常見的缺陷 無菌檢驗的局限性 無菌檢驗樣品的取樣控制 無菌檢驗用培養(yǎng)基及其靈敏度檢查 無菌檢查方法和驗證 無菌檢驗過程中的污染控制 無菌檢驗陽性結果的調查,1 GMP檢查中常見的缺陷,未建立XXX注射液無菌檢查的檢驗操作規(guī)程，現(xiàn)企業(yè)出示的無菌檢驗規(guī)程僅抄錄中國藥典附錄“無菌檢查”的內(nèi)容。 XXX注射液檢驗標準操作規(guī)程中無菌檢查項目無具體操作程序。 凍干粉針劑產(chǎn)品的無菌試驗方法驗證不符合2005年版中國藥典的要求。 配制后的培養(yǎng)基未按規(guī)定的條件滅菌并進行靈敏度試驗。,1 GMP檢查中常見的缺陷,檢定用菌種的傳代記錄過于簡單，無代次內(nèi)容。 對檢

2、定菌的管理不完善，未對檢定菌的使用情況進行記錄。陽性菌的菌種傳代記錄內(nèi)容不完整，未登記購入菌種的編號。 無菌檢查記錄不及時，不完整，對該企業(yè)檢驗室進行現(xiàn)場檢查時，正在進行無菌檢查培養(yǎng)的批次產(chǎn)品的無菌檢查記錄尚未填寫，僅登記了無菌檢查工作臺帳， 2006年8月30日進行無菌檢查在無菌檢查工作臺帳有登記的XXX批XXX產(chǎn)品，在33度孵化室內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有相應的集菌器，且無任何異常情況記錄。,1 GMP檢查中常見的缺陷,無菌檢驗不合格后進行復試無相應文件規(guī)定，且復試前的分析評估內(nèi)容簡單。 微生物培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)箱的溫度未如實記錄，如現(xiàn)場檢查時02號培養(yǎng)箱顯示箱內(nèi)溫度為26.5度，該培養(yǎng)箱溫度記錄從2006年1

3、月1日至8月8日記錄的溫度均為24.6度。,2. 何為無菌,理論上: 無菌 = 完全沒有生命,而實際上: 我們無法證明產(chǎn)品中沒有活微生物存在 無法對整批進行100%檢驗 無菌檢驗的結果只是一個基于“可能性”的判斷 無菌檢驗用培養(yǎng)基有其局限性 只進行細菌和真菌的檢驗 對實驗結果的判定是基于“是否在培養(yǎng)基中生長” 我們的工作環(huán)境及操作是在相對無菌的狀態(tài),3. 無菌檢驗 _ 取樣計劃,我們期望什么? 在整批產(chǎn)品中無微生物存在 我們做的是什么測試? 無菌檢驗是一個破壞性的實驗 我們不能對整批進行100%檢驗 如何通過無菌檢驗來證明整批產(chǎn)品無菌？ 要求有一個取樣計劃來涵蓋整個批號 有足夠的取樣量和檢驗量

4、,什么是批? 在同一條件下制備出的密封容器的集合（具有同質性），其每個單位容器被污染的幾率是一樣的。 如何對批進行取樣？ 用于無菌檢驗的樣品必須具有批代表性，但尤其要考慮從最易污染的位置取樣（摘自英國藥典）,3. 無菌檢驗 _ 取樣計劃,何時取? 如何取? 無菌灌裝產(chǎn)品： 批開始、結束及重大故障和調整后。 最多24小時為一批 USP . 每天灌裝的產(chǎn)品應分別做無菌檢驗. 最終滅菌產(chǎn)品： 從滅菌柜中最冷點取樣。 對經(jīng)不同滅菌柜滅菌的產(chǎn)品應分別進行無菌檢驗。 連續(xù)工藝： 產(chǎn)品被連續(xù)地單個滅菌，如：用電子束滅菌，一批不大于24小時。,3. 無菌檢驗 _ 取樣計劃,取多少樣 （檢驗數(shù)量）? 藥典上規(guī)定

5、每次無菌檢驗的最少取樣數(shù)量 取決于批量，如：中國藥典2005版 ，注射劑： 大于500：取2% 或20支（取少），用于每個培養(yǎng)基檢驗 小于等于100：取10%或4個（取多），用于每個培養(yǎng)基檢驗 取決于劑量. 如：中國藥典2005版 ，劑量小于1毫升，就要取40支 同時要考慮檢驗損耗和復試,3. 無菌檢驗 _ 取樣計劃,每個樣品測多少? （檢驗量） 藥典上規(guī)定了每次檢驗的供試品總量，如：中國藥典2005版 裝量小于 1 ml：每支樣接入每個培養(yǎng)基為全量 裝量大于等于 1 ml. EP: 半量，但不超過20 ml. CP: 半量， 2 to 500 ml USP: ,3. 無菌檢驗 _ 取樣計劃,

6、取樣的局限性 相對于整個批量而言，取樣的數(shù)量是十分有限的，如： 若在有1%產(chǎn)品污染的批號中取20個樣品進行檢驗，80%的可能無菌檢驗通過。 若在有5%產(chǎn)品污染的批號中取20個樣品進行檢驗，30%的可能無菌檢驗通過。 無菌檢驗通過的可能性是基于整批產(chǎn)品的受污染程度。,3. 無菌檢驗 _ 取樣計劃,美國非腸道藥物學會注射劑無菌測試結果,試驗目的：不合格的可能性(%) 試驗批量：60,000支 試驗方法：按美國藥典無菌測試方法,取樣的局限性 （續(xù)） 檢驗數(shù)量多少影響檢驗通過與否。 檢驗量的降低會使檢出率降低。 無菌檢驗只能給出該批產(chǎn)品使污染的程度。 無菌檢驗通過只能說明被測樣品無菌，不能證明整批無菌

7、。,3. 無菌檢驗 _ 取樣計劃,結論: 要有一個完整的取樣計劃涵蓋整個批生產(chǎn)過程，并要考慮到“最壞情況”以提高檢出可能性。 檢驗數(shù)量和檢驗量應滿足藥典要求。,3. 無菌檢驗 _ 取樣計劃,我們期望什么? 在整批產(chǎn)品中無微生物存在 我們做的是什么測試? 無菌檢驗是通過目檢微生物在培養(yǎng)基中的生長來判斷結果 如何通過無菌檢驗來證明整批產(chǎn)品無菌？ 能支持微生物生長并無菌_ 培養(yǎng)基的靈敏度檢查 培養(yǎng)基的保存控制 無抑制微生物生長的因素存在_ 方法驗證試驗,4. 無菌檢驗 _ 培養(yǎng)基,4. 無菌檢驗 _ 培養(yǎng)基,檢驗用培養(yǎng)基 兩種微生物培養(yǎng)基： 用于真菌培養(yǎng)的改良馬丁培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度：23-28。 用于

8、厭氧和需氧細菌培養(yǎng)的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度：30-35。,4. 無菌檢驗 _ 培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的靈敏度檢查 所有培養(yǎng)基必須無菌 從每批培養(yǎng)基中隨機取樣，培養(yǎng)14天：中國藥典5瓶；美國藥典10%或20瓶（取少）。 按藥典要求所列的菌種表，證明培養(yǎng)基靈敏度。 接種 10-100 cfu 需氧菌- 金葡、銅綠和枯草- 至FT 30 35培養(yǎng) 3天 接種 10-100cfu 厭氧菌- 生孢梭菌- 至 FT 30 35培養(yǎng)3天 接種 10-100cfu 真菌- 白念、黑曲霉 至 UM 23 28培養(yǎng) 5天 要求從生產(chǎn)環(huán)境中分離出的典型菌株 在培養(yǎng)基中生長良好 所用菌株傳代次數(shù)小于等于5代,4. 無

9、菌檢驗 _ 培養(yǎng)基,培養(yǎng)基保存控制 應規(guī)定保存有效期: 在密閉容器中一年，并在靈敏度檢查后3月內(nèi)使用 防氧化 選擇長寬比例恰當?shù)娜萜?，以減少與空氣的接觸面 2-25保存 確保pH 在密閉容器中保存,4. 無菌檢驗 _ 培養(yǎng)基,無菌檢驗用培養(yǎng)基的局限性； 藥典規(guī)定的培養(yǎng)基所能支持生長的微生物是有限的。 微生物包括：原生生物、細菌、真菌、支原體和病毒等。 這些微生物有廣泛的生長要求，如：營養(yǎng)、溫度、氧等 無菌檢驗培養(yǎng)基不可能支持所有微生物的生長，它們只是針對于那些最有可能污染藥品和在藥品中生長的微生物。,結論: 在無菌檢驗中使用兩種微生物培養(yǎng)基 每批滅菌后都應進行靈敏度檢查 有效控制微生物培養(yǎng)基的

10、保存和效期 方法驗證證明在當前實驗條件下，對產(chǎn)品的無菌檢驗沒有抑菌因素的干擾,4. 無菌檢驗 _ 培養(yǎng)基,5. 無菌檢驗 _ 方法,藥典規(guī)定兩種方法: 直接接種法: 樣品直接移入無菌培養(yǎng)基中 薄膜過濾法 _ 80% 產(chǎn)品用0.45m膜過濾并用3x 100ml無菌蛋白胨水淋洗后加入培養(yǎng)基。膜的選擇應保證膜在使用前后的完整性。 替代方法: 生物指示劑替代法：以菌片替代產(chǎn)品進行無菌檢查 （一般只用于器械）菌片放置位置需要驗證,直接接種法 用于不能過濾的樣品 若樣品本身的混濁，可能要求再培養(yǎng)- 延長了檢驗周期 樣品的檢驗量有限制， 接種體積不能大于培養(yǎng)基體積的10%，因此就要求更多的培養(yǎng)基 可能要考慮

11、對樣品中抑菌因素進行中和 易污染 由于該方法是敞開式的 應培養(yǎng)基管數(shù)與檢驗數(shù)量一致，則提高了所用培養(yǎng)基容器數(shù)量,5. 無菌檢驗 _ 方法,薄膜過濾法 不適用于無法溶解的樣品，如無菌衣或腸線 大體積檢驗量，不存在稀釋培養(yǎng)基問題 樣品中的抑菌因素可被濾除 中和試劑可應用在淋洗液中，如：-內(nèi)酰胺酶 分散劑可作為溶劑，如十四烷酸異丙酯 不必再培養(yǎng)，因此檢驗周期確定 大樣品檢驗量不必增加培養(yǎng)基。 可以是封閉系統(tǒng)，如 STERITEST，降低污染可能性 培養(yǎng)基較清澈，易觀察生長情況,5. 無菌檢驗 _ 方法,5. 無菌檢驗 _ 方法,兩種方法的共同點: - 培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度 - 培養(yǎng)時間 - 工作環(huán)境：1

12、00級區(qū)域或隔離系統(tǒng)中進行,5. 無菌檢驗 _ 方法,方法驗證試驗 _ 證明在試驗條件下沒有抑菌作用，如：防腐劑，抗生素 完全按照常規(guī)檢驗方法進行，除進行下列改變： 在產(chǎn)品中加入與培養(yǎng)基靈敏度檢查相同的需氧、厭氧和真菌菌株（ 10-100cfu），進行常規(guī)檢驗。 在要求的溫度下培養(yǎng)3-5天，生長良好。 下列情況應進行重新驗證： 檢驗方法變更 培養(yǎng)基變更 產(chǎn)品處方變更,5. 無菌檢驗 _ 方法驗證,結果判斷： 培養(yǎng)結束后，目測培養(yǎng)基是否渾濁 無微生物生長表示檢驗通過 有微生物生長表示供試品不合格 對不合格結果應進行調查,5. 無菌檢驗 _ 方法,結論: 有兩種檢驗方法，但所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、時

13、間相同 過濾膜應淋洗至少3次，但總淋洗體積不能超過1000ml 培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有生長,5. 無菌檢驗 _ 方法,6. 無菌檢驗 _ 污染控制,藥典標準使作出“檢驗結果無效”的判斷十分困難 除非有充足的證據(jù)證明無菌檢驗是在實驗室被污染 所以實驗室污染控制就十分重要，以避免由于檢驗事故造成整批產(chǎn)品報廢,無菌檢驗用實驗室 中國藥典2005 要求, 無菌檢驗應在無菌環(huán)境下進行（100級或隔離系統(tǒng)） 其潔凈和微生物要求與無菌生產(chǎn)廠房一致 其控制要求與生產(chǎn)區(qū)域一致，如：空調、更衣、清潔、緩沖_ 定期驗證 應有環(huán)境監(jiān)控程序并根據(jù)實際情況設定行動線,6. 無菌檢驗 _ 污染控制,6. 無菌檢驗

14、_ 污染控制,樣品 在樣品進入無菌區(qū)前應進行消毒處理 在進行樣品外表面消毒時，應確保樣品的完整性 考慮所用消毒液滲透過樣品容器的可能性，如：透過塑料容器,6. 無菌檢驗 _ 污染控制,設備與培養(yǎng)基 所有與無菌測試接觸的設備和培養(yǎng)基都必須無菌 所有進入無菌檢驗區(qū)域的設備要滅菌或消毒 每批培養(yǎng)基都應在使用前或與無菌檢驗平行進行無菌和靈敏度測試 所有培養(yǎng)基在使用前應檢查，無渾濁和顆粒 使用封閉的無菌檢驗系統(tǒng)，如 steritest 使用隔離技術，如隔離系統(tǒng); 盡量自動化,6. 無菌檢驗 _ 污染控制,陰性對照： 不加樣品的無菌檢驗 與無菌檢驗同時做 對操作者，設備和培養(yǎng)基控制 若使用隔離系統(tǒng)則可能不

15、必 陽性對照 對操作進行控制，避免無菌操作中的抑菌作用,6. 無菌檢驗 _ 污染控制,7 無菌檢驗 _ 陽性結果的調查,藥典標準使作出“檢驗結果無效”的判斷十分困難, 如 CP2005 and USP 無菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌檢查法要求 回顧無菌測試過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素 陰性對照有菌生長 供試品中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗中所用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的,7. 無菌檢驗 _ 陽性結果的調查,無菌測試的陽性結果 鑒定 + 重復陰性對照試驗,調查測試的有效性,重復測 試結果,復測,QA,用分離菌進行陽性對 照測試,試驗有效,試驗無

16、效,合格,不合格,合格,不合格,支持生長,不支持生長,停止實驗室調查產(chǎn)品不合格,實驗室調查：一個合適的調查程序和記錄是必要的,結束了嗎？,停止實驗室調查產(chǎn)品不合格,產(chǎn)品檢測合格,若產(chǎn)品不合格，必須通過該批生產(chǎn)過程回顧找出污染原因和污染源 人 物料 環(huán)境 設備 方法和工藝 所有無菌檢驗失敗和產(chǎn)品不合格數(shù)據(jù)應保留記錄并歸納在一個分類表中，進行定期回顧和分析 偏差處理和定期生產(chǎn)回顧,7. 無菌檢驗 _ 陽性結果的調查,滅菌柜滅菌參數(shù)記錄 培養(yǎng)基、設備準備使用記錄 培養(yǎng)基靈敏度測試記錄 培養(yǎng)箱溫度記錄 設備物料記錄無菌室的記錄 設備校驗維護記錄,隔離系統(tǒng)滅菌記錄 清潔記錄 測試數(shù)據(jù) 環(huán)境監(jiān)控記錄 趨勢分析 無菌檢驗失敗調查記錄,為便于調查而要求的文件,所有與檢驗相關的可追溯性文件都必須保留,7. 無菌檢驗 _ 陽性結果的調查,結論: 在根本原因找出前，千萬不能隨意丟棄無菌檢驗結果 注意：沒有記錄就表示沒有做 所有無菌檢驗結果和調查數(shù)據(jù)應保存并規(guī)類進行趨勢分行,7. 無菌檢驗 _ 陽性結果的調查,8. 無菌檢驗