1、第四章 微生物的營養(yǎng)與培養(yǎng)基,第四章 微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)基,營養(yǎng) 微生物獲得和利用營養(yǎng)物質(zhì)的過程 營養(yǎng)物質(zhì) 能夠滿足機(jī)體生長、繁殖和完成各種生理活動所需要的物質(zhì),營養(yǎng)物質(zhì)是微生物生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，而營養(yǎng)是微生物維持和延續(xù)其生命形式的一種生理過程。,第一節(jié) 微生物的 6 類營養(yǎng)要素,微生物細(xì)胞的元素組成,主要元素：碳、氫、氧、氮，磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣占干重的90%97%,微量元素：鋅、錳、氯、鉬、硒、鈷、銅等占干重的3%10%,微生物細(xì)胞的物質(zhì)組成,1、水分,水是微生物及一切生物細(xì)胞中含量最多的成分。,通常情況下，細(xì)菌含水量為細(xì)胞鮮重的 75%85% 酵母菌含水量為細(xì)胞鮮重的 70%85% 絲狀

2、真菌 85%90% 細(xì)菌芽孢和霉菌孢子 40%,2、干物質(zhì),有機(jī)物質(zhì)：蛋白質(zhì)（肽和氨基酸）、核酸、類脂、碳水化合物、維生素和其他有機(jī)物質(zhì)（占干重的90%95%）,礦質(zhì)元素：占3%10%,蛋白質(zhì)是細(xì)胞干物質(zhì)中含量最多的成分，占干重的50%，是重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)。,核酸與核苷酸,核酸有DNA（含量穩(wěn)定）、RNA （含量變化較大）,類脂,包括：脂肪、磷脂、甾醇、蠟和多聚-羥基丁酸等 是許多種微生物的儲藏物質(zhì)。,碳水化合物,多糖、寡糖和單糖，參與組成各種細(xì)胞結(jié)構(gòu),維生素,主要是B族維生素，是細(xì)胞中多種酶的輔酶或活性基團(tuán)，是保持酶活性必需的成分。,其他有機(jī)物質(zhì),核黃素、尼克酰胺和細(xì)胞色素、抗生素、激素及

3、毒素等,微生物的營養(yǎng)物質(zhì),6種營養(yǎng)要素,水、碳源、氮源、能源,生長因子、無機(jī)鹽,返回目錄,（一）水,1、水活度（aw） （p98）,在相同溫度和大氣壓下，密閉容器中溶液水的飽和蒸汽壓和純水蒸汽壓的比值，反映微生物可利用水分的多少。,當(dāng)aw=0 干燥,當(dāng)aw=1 純水,微生物的aw：（0.60，0.99）,2、水的形態(tài),A、 結(jié)合水：不流動，不易蒸發(fā)，不凍結(jié)，不能作為溶劑，也不滲透,B、 與結(jié)合水相反,2、水的生理功能主要有,營養(yǎng)物質(zhì)的溶劑，營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞和代謝廢物排出細(xì)胞均以水為媒介。 維持生物大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和酶的活性 細(xì)胞內(nèi)的一切生化反應(yīng)均在水介質(zhì)系統(tǒng)中進(jìn)行 水是藍(lán)細(xì)菌等少數(shù)微生物還原CO

4、2時的供氫體 一定量的水分是維持細(xì)胞膨脹壓的必要條件 水能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的溫度,（二）碳源 （p87）,1、概念,凡能提供微生物營養(yǎng)所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)稱為碳源。,碳源,其中糖類是最廣泛的碳源，其次為醇類、有機(jī)酸、脂等； 單糖優(yōu)于雙糖和多糖；己糖優(yōu)于戊糖；葡萄糖、果糖優(yōu)于甘露糖和半乳糖；淀粉優(yōu)于纖維素和幾丁質(zhì)等純多糖，又優(yōu)于瓊脂、木質(zhì)素等雜多糖。,2、碳源分類,CO2、CO32-,糖類、有機(jī)酸、醇、脂類 烴類及芳香族化合物,3、常用的碳源,常以糖類提供C源,淀粉類（玉米粉、小麥粉、野生植物）,凡是能提供微生物生長繁殖所需氮素的營養(yǎng)物質(zhì)稱為氮源。,（三）氮源 （p88）,1、概念,2、分類,3、

5、常用的氮源,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏,魚粉、花生、豆餅粉、麩皮、蛹粉,四. 無機(jī)鹽（礦質(zhì)鹽類） （p90）,1、主要功能 構(gòu)成微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)（P、S、Ca、Mg、Fe）。 酶活性基的組成分和酶的激活劑（Cu2+、Mn2+、Zn2+） 調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、PH值和氧化還原點位（Na、P、K）。 化能自養(yǎng)菌的能源（S、Fe、NH4+、NO2-）,微生物生長必需的微量有機(jī)物質(zhì)稱為生長因子或生長素。,2、分類,大量元素： 需要濃度在10-310-4mol/L范圍內(nèi)的元素P、S、K、Na、Ca、Mg、(Fe ) 微量元素：需要濃度在10-610-8mol/L范圍內(nèi)的元素(Fe ) Cu、Zn、Mn、Mo、C

6、o、B等。,五. 生長因子,1、定義,2、生長因子有：氨基酸、維生素、堿基,3、按微生物與生長因子的關(guān)系將微生物分為3種類型,生長因子自養(yǎng)型微生物,野生型或原養(yǎng)型菌株,生長因子異養(yǎng)型微生物,有些微生物失去或沒有合成生長素類物質(zhì)能力的微生物叫營養(yǎng)缺陷型。乳酸菌、各種動物病原菌、支原體,生長因子過量合成微生物,六. 能源 （p89）,1、概念,能提供給微生物生命活動的最初能量來源的營養(yǎng)物或輻射能稱為能源。,2、能源譜,單功能營養(yǎng)物：如輻射能 雙功能營養(yǎng)物：NH4+是硝酸細(xì)菌的能源和氮源 三功能營養(yǎng)物：如”N.C.H.O”是異養(yǎng)微生物的能源、碳源及氮源。,第二節(jié) 微生物的營養(yǎng)類型,第三節(jié) 營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)

7、入細(xì)胞的方式,吞噬作用,圖1,氧 CO2 乙醇 氨基酸,單純擴(kuò)散示意圖,一、單純擴(kuò)散,物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的動力是細(xì)胞內(nèi)外的濃度差。 不消耗能量 沒有特異性，被運(yùn)輸物質(zhì)不與膜上物質(zhì)發(fā)生任何反應(yīng)，物質(zhì)不發(fā)生化學(xué)變化。,單純擴(kuò)散(simple diffusion)特點,二、促進(jìn)擴(kuò)散,圖3促進(jìn)擴(kuò)散示意圖,促進(jìn)擴(kuò)散(facilitated diffusion)過程： 膜載體在膜外與營養(yǎng)物質(zhì)親合力強(qiáng)，與這種物質(zhì)結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞后親合力降低釋放營養(yǎng)物質(zhì)。像渡船一樣，膜外裝貨，膜內(nèi)卸貨，這種擴(kuò)散方式比單純擴(kuò)散速度快。 膜內(nèi)外親合力的改變與載體分子構(gòu)型改變有關(guān)。,促進(jìn)擴(kuò)散 （p93）,特點,不消耗能量,參與運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)本

8、身的分子結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化,不能進(jìn)行逆濃度運(yùn)輸,運(yùn)輸速率與膜內(nèi)外物質(zhì)的濃度差成正比,需要載體參與,圖4 主動運(yùn)輸示意圖,被運(yùn)送的物質(zhì)可逆濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 消耗能量，必需有能量參加。 有膜載體參加，膜載體發(fā)生構(gòu)型變化 被運(yùn)送物質(zhì)不發(fā)生任何變化。,三、主動運(yùn)輸特點,基團(tuán)轉(zhuǎn)位：在研究糖的運(yùn)輸時發(fā)現(xiàn)的一種主動運(yùn)輸方式。 運(yùn)輸過程中需要能量，被運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)發(fā)生化 學(xué)變化的運(yùn)輸叫基團(tuán)移位。 許多糖靠基團(tuán)移位進(jìn)行運(yùn)輸。 這種運(yùn)輸方式是微生物通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)來運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的。,四、基團(tuán)移位(group translocation),Group Translocation,基團(tuán)移位,基團(tuán)轉(zhuǎn)移運(yùn)輸特點：（p93）

9、需要磷酸酶系統(tǒng)進(jìn)行催化 被運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)發(fā)生化學(xué)變化，被磷酸化 需要能量,4 種運(yùn)送方式 總結(jié),比較項目 單純擴(kuò)散 促進(jìn)擴(kuò)散 主動運(yùn)輸 基團(tuán)移位 特異載體蛋白 無 有 有 有 運(yùn)送速度 慢 快 快 快 溶質(zhì)運(yùn)送方向 由濃至稀 由濃至稀 由稀至濃由稀至濃 平衡時內(nèi)外濃度內(nèi)外相等 內(nèi)外相等 內(nèi)部高內(nèi)部高 運(yùn)送分子 無特異性 特異性 特異性特異性 能量消耗 不需要 需要 需要需要 運(yùn)送前后溶質(zhì)分子不變 不變 不變改變 載體飽和效應(yīng)無 有 有 有 與溶質(zhì)類似物 無競爭性有競爭性有競爭性有競爭性 運(yùn)送抑制劑 無 有 有 有 運(yùn)送對象舉例 水、O2 糖、SO42-氨基酸、乳糖 葡萄糖嘌呤,4種運(yùn)送營養(yǎng)方式的比

10、較,第四節(jié) 培養(yǎng)基,人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。,營養(yǎng)物質(zhì)：水、碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因子,定義,培養(yǎng)基的要素,水的活度： 0 aw 1，微生物（0.60，0.99）,培養(yǎng)基幾乎是一切對微生物進(jìn)行研究和利用工作的基礎(chǔ),細(xì)菌 酵母菌 霉菌、放線菌 耐鹽菌 0.90.99 0.8以上 0.7以上 0.6以上,培養(yǎng)基的物理狀態(tài)：固、液、半固體,滅菌方法：,常規(guī)高壓蒸汽滅菌： 1.05kg/cm2 ,121.5 15-30分鐘；,任何培養(yǎng)基一旦配成，必須立即進(jìn)行滅菌處理。,目的明確,營養(yǎng)協(xié)調(diào),理化條件適宜,經(jīng)濟(jì)節(jié)約,一、設(shè)計培養(yǎng)基的原則 （p96）,1.目的明確 （p

11、96）,根據(jù)不同的微生物的營養(yǎng)要求配制針對強(qiáng)的培養(yǎng)基,培養(yǎng)化能自養(yǎng)型的氧化硫桿菌的培養(yǎng)基組成為： S 10g MgSO4.7H2O 0.5g (NH4)2SO4 0.4g FeSO4 0.01g KH2PO4 4g CaCl2 0.25g H2O 1000ml,培養(yǎng)化能異養(yǎng)的大腸桿菌一種培養(yǎng)基是由下列化學(xué)成分組成： 葡萄糖 5g NH4H2PO4 1g NaCl 5g MgSO4.7H2O 0.2g K2HPO4 1g H2O 1000ml,2. 營養(yǎng)協(xié)調(diào) （p96）,培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時微生物才能生長良好，營養(yǎng)物質(zhì)濃度過低時不能滿足微生物正常生長所需，濃度過高時則可能對微生物生長起抑制

12、作用。,培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比直接影響微生物的生長繁殖和代謝產(chǎn)物的形成和積累，碳氮比（C/N）的影響較大。,碳氮比：培養(yǎng)基中碳元素與氮元素的物質(zhì)的量比值，有時也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白之比。,例：利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸 1、培養(yǎng)基碳氮比：4/1 菌體量繁殖，谷氨酸積累少； 2、培養(yǎng)基碳氮比：3/1 菌體繁殖受到抑制，谷氨酸產(chǎn)量大量增加。,3. 理化條件適宜 （p97),pH,水活度,氧化還原電位,a. pH,培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型 微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。,通常培養(yǎng)條件 （p97） 細(xì)菌與放線菌：pH77.5 酵母菌和霉菌：pH4.56范圍內(nèi)生長

13、,為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定，通常在培養(yǎng)基中加入 pH緩沖劑，或在進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵時補(bǔ)加酸、堿。,b. 水活度 aw,在天然環(huán)境中，微生物可實際利用的自由水或游離水的含量， 純水w為1.00,溶液中溶質(zhì)越多, w越小。,微生物一般在w為0.600.99的條件下生長, w過低時,微生物生長的遲緩期延長,比生長速率和總生長量減少。微生物不同，其生長的最適w不同。,c. 氧化還原電位,氧化還原電位又稱氧化還原電勢（redox potential）：度量某氧化還原系統(tǒng)中的還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢的一種指標(biāo)，單位是V（伏）或mV（毫伏）。,好氧性微生物：+0.1伏以上時可正常生長,以+0.3+0

14、.4伏為宜； 厭氧性微生物：低于+0.1伏條件下生長； 兼性厭氧微生物：+0.1伏以上時進(jìn)行好氧呼吸, +0.1伏以下時進(jìn)行發(fā)酵。,4. 經(jīng)濟(jì)節(jié)約,以粗代精,以野代家,以廢代好,以國代進(jìn),以簡代繁,以氮代朊,以烴代糧,以纖代糖,二、培養(yǎng)基的種類 （p100）,培養(yǎng)基種類繁多，根據(jù)其成分、物理狀態(tài)和用途可將培養(yǎng)分成多種類型,（一）按培養(yǎng)基的成分區(qū)分 （p100）,A、 天然培養(yǎng)基：用各種動物、植物和微生物材料制作的成分含量不完全清楚且變化不定的營養(yǎng)基質(zhì),配制天然培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏米曲汁、麥芽汁、馬鈴薯、玉米粉、麩皮及花生餅粉等,優(yōu)點：取材廣泛、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)簡便、微生物生

15、長迅速，適合各種異養(yǎng)微生物生長,缺點：成分不完全清楚，成分和含量不確定，用于精細(xì)實驗時重復(fù)性差。,B、 合成培養(yǎng)基：完全用化學(xué)藥品配制而成,特點：化學(xué)成分和含量完全清楚且固定不變，適于生長、繁殖，適用于進(jìn)行營養(yǎng)、代謝、生理生化、遺傳育種及菌種鑒定等精細(xì)研究。,缺點：一般微生物在合成培養(yǎng)基上生長緩慢,C、 半合成培養(yǎng)基：既有天然物質(zhì)又有化學(xué)藥品的培養(yǎng)基,天然培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基,含用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基,化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基,高氏1號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基,(二）按物理狀態(tài)不同劃分,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,在液體培養(yǎng)基中加入一

16、定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%,瓊脂含量一般為0.2%-0.7%,不加任何凝固劑,半固體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基常用來進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏,觀察微生物的運(yùn)動特征、分類鑒定及噬菌體效價滴定,大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實驗室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究,（三）按用途不同劃分,基礎(chǔ)培養(yǎng)基,鑒別培養(yǎng)基,含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基,用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基,用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,

17、加富培養(yǎng)基,特殊營養(yǎng)物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動植物組織液等,在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長,微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化,K2HPO4 30g KH2PO4 10g NH4NO3 5g Na2SO4 1g MgSO4.7H2O 10mg MnSO4.4H2O 10mg FeSO4.7H2O 10mg CaCl2 5mg H2O 1000ml,例如，培養(yǎng)細(xì)菌 營養(yǎng)缺陷型菌株 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,b 、 加富培養(yǎng)基（富集培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基）：根據(jù)待分離微生物特殊營養(yǎng)要求配制的適合

18、該類微生物快速生長而不利于其他微生物生長的營養(yǎng)基質(zhì)（投其所好）,a 、 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：按照微生物的共同營養(yǎng)要求配制。使用前加入少數(shù)幾種特殊成分就能滿足某一具體微生物生長需要的營養(yǎng)基質(zhì)。,按培養(yǎng)基的功能區(qū)分,c 、 選擇培養(yǎng)基：利用分離對象對某些化學(xué)物質(zhì)的抗性或生理特長設(shè)計的能抑制或限制其它微生物生長而使分離對象正常生長的營養(yǎng)基質(zhì)（取其所抗）。,d 、鑒別培養(yǎng)基：利用微生物代謝產(chǎn)物與指示劑的顯色反應(yīng)快速鑒別不同微生物的營養(yǎng)基質(zhì),伊紅美蘭培養(yǎng)基、Pb(Ac)2培養(yǎng)基,無色代謝產(chǎn)物+特定試劑,產(chǎn)生明顯特征（變色、沉淀）,一些常用的鑒別培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)基 用于合成某種預(yù)定的發(fā)酵產(chǎn)物的培養(yǎng)基。 特點： 碳

19、源比例高* 原料粗放、成本低 符合工藝及后提取的要求。,遺傳研究用培養(yǎng)基： 基本培養(yǎng)基（MM）：僅能滿足某微生物的野生菌株生長所需的最低養(yǎng)分的培養(yǎng)基。 完全培養(yǎng)基（CM）：凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株生長需要的培養(yǎng)基。 分析培養(yǎng)基：維生素、抗生素、分析微生物營養(yǎng)要求,補(bǔ)充：常見的培養(yǎng)四大類微生物的培養(yǎng)基:,細(xì)菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g H2O 1000ml,放線菌（高氏1號） 淀粉 20g K2HPO4 0.5g NaCl 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g KNO3 1g FeSO4 0.01g H2O 1000ml,酵母菌(麥芽汁培養(yǎng)基)

20、干麥芽粉加四倍水，在50-60保溫糖化3-4小時，用碘液試驗檢查至糖化完全為止，調(diào)整糖液濃度，煮沸后，沙布過濾，調(diào)PH為6.0。,霉菌（查氏合成培養(yǎng)基） NaNO3 3g K2HPO4 1g KCl 0.5g MgSO4.7H2O 0.5gFeSO4 0.01g 蔗糖 30g H2O 1000ml,補(bǔ)充：配制培養(yǎng)基應(yīng)注意的問題,營養(yǎng)成分的溶解 緩沖性物質(zhì)，高溫易破壞的組分， 易沉淀的組分， 高溫易發(fā)生反應(yīng)的組分， 微量物質(zhì)， pH值及水活度 加瓊脂 滅菌：高壓蒸汽滅菌，1.05kg/cm2（0.1MPa），1530min；分別滅菌；過濾除菌；間歇滅菌； 0.56kg/cm2，112.6， 1530min；加消泡劑；含脂、糖、蛋白質(zhì)高、固體培養(yǎng)基、pH低滅菌時間要長一些。,出現(xiàn)問題的解決,混濁和沉淀 褐色物質(zhì)的形成 膠體強(qiáng)度的破壞,可能與培養(yǎng)基中含有2價、3價金屬離子和可溶性磷酸鹽有關(guān)（加螯合劑） 還原糖類、蛋白質(zhì)與氨基酸在高壓、高溫下相互作用的結(jié)果，“焦化”或美拉德反應(yīng) pH值降到4.5以下，瓊脂固體培養(yǎng)基滅菌后，瓊脂被熱水解而不再凝固，或凝固不堅。,所謂美拉德反應(yīng)即葡萄糖與氨