1、PLGA微粒/納米?；蜉d體的研究進展,藥學(xué)學(xué)報,基因治療是生物治療的重要組成部分，該療法在治療多種人類重大疾病如遺傳病、惡性腫瘤、代謝性疾病以及感染性疾病 (如AIDS、乙型肝炎)等方面具有良好的應(yīng)用前景，并將逐漸成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點。,聚乳酸-羥基乙酸共聚物 poly(1actic-co-glycolicacid ),PLGA 是一類可降解的功能高分子有機聚合物，通過美國FDA認(rèn)證，具有良好的生物相容性、無毒、無刺激性、無免疫原性和藥物緩釋等特性，廣泛應(yīng)用于基因載體。PLGA一般制成微?；蚣{米粒 ( 簡稱微/納米)。,大量研究表明細胞對載體的攝取效率和靶向性具有明顯的尺寸依賴性，PL

2、GA微/納米顆粒粒徑小，顯著提高了細胞的攝取率和目的基因的表達水平。同時，微/納米載體比表面積大，可在表面進行親水性修飾和靶向性修飾。在提高基因攜帶率的同時實現(xiàn)基因治療的主動靶向性。由此可見， PLGA微/納米基因載體在基因治療中具有明顯優(yōu)勢。,PLGA微/納米基因載體的： 特點 制備方法 表面修飾方式 在基因治療方面的研究進展,特 點,PLGA由乳酸(LA)和羥基乙酸(GA)兩種單體聚合而成。 通過改變聚合物單體比例和分子量可以調(diào)控共聚物在體內(nèi)的降解速度、DNA 包封率以及基因體外釋放速度。,目前，LA和GA常用比例為 75：25和50：50。 適當(dāng)分子量的 PLGA可提高 pDNA釋放速度

3、和自身降解速度，更適合用作基因載體。,PLGA微/納米載體與 pDNA的結(jié)合方式也會影響 pDNA 的包封率和釋放速度。,其結(jié)合方式主要有兩種：,一種是將 DNA包裹于PLGA微/納米顆粒內(nèi)部。 這種方式能避免 pDNA 在細胞轉(zhuǎn)染時受外部環(huán)境的影響，更好保護pDNA的結(jié)構(gòu)完整性，但是其釋放速度慢，pDNA易受制備過程中有機溶劑和機械力破壞；,其結(jié)合方式主要有兩種：,另一種方式是將pDNA吸附在 PLGA表面，即PLGA 載體制備完成后，在溫和條件下與 pDNA反應(yīng)完成。 該方式反應(yīng)條件溫和，制備過程對 pDNA 影響較小，但是細胞轉(zhuǎn)染時外部環(huán)境如pH等對pDNA結(jié)構(gòu)影響較大。,PLGA微/納

4、米載體在介導(dǎo)基因傳遞方面也具有一定的優(yōu)勢。,微/納米顆粒的特殊結(jié)構(gòu)和表面電荷具有較高的基因轉(zhuǎn)移效率，可介導(dǎo)外源基因在細胞染色體DNA中的整合，從而獲得基因長期穩(wěn)定的表達。,微/納米載體可以保護轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，減少機體血漿或組織細胞中各種補體以及各種酶的破壞有利于目的基因在轉(zhuǎn)導(dǎo)進入靶細胞后更好更穩(wěn)定地發(fā)揮作用。,PLGA微/納米基因載體制備方法,制備方法,復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法 自乳化溶劑擴散法 噴霧干燥法 CO2超臨界流體乳液萃取法 溶劑置換法 納米粒沉淀法,不同的制備方法影響載體粒徑大小和 pDNA包封率，不同粒徑大小的 PLGA微/納米基因載體又有不同的用途。,復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法,是制備PLGA載體常用的一

5、種方法。 將DNA溶于內(nèi)水相，PLGA 溶于有機溶劑作為中間相，聚乙烯醇 ( PVA )等乳化劑作為外水相，通過高速均質(zhì)或超聲乳化等方式得到 PLGA 乳狀液，室溫攪拌蒸發(fā)有機溶劑得到 PLGA微/納米顆粒。,復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法,該法可以通過調(diào)節(jié)攪拌速度和乳化劑濃度來改變粒徑大小，當(dāng)攪拌速度和PVA濃度達到一定時，粒徑可控制在300nm以下，pDNA包封率可達90以上。,缺點：,盡管復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法對pDNA 的包封率較高，但水油兩相之間的界面張力和制備過程中施加的機械外力會引起超螺旋pDNA 的開環(huán)或降解，且由于pDNA 降解產(chǎn)物的活性和轉(zhuǎn)染效率遠不及超螺旋pDNA,這在很大程度上限制了復(fù)乳溶劑蒸

6、發(fā)法的應(yīng)用。,自乳化溶劑擴散法,避免了復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法中使用的強機械力，保證了pDNA結(jié)構(gòu)的完整性。 該法將PLGA溶于兩種有機溶劑中，一種疏水性較強(二氯甲烷)，一種親水性較強(丙酮、乙醇等)，將有機相逐滴加入水相中，親水性有機溶劑迅速擴散到水相中形成小液滴，減少了界面張力，同時通過攪拌去除有機溶劑形成PLGA 微納米粒。,自乳化溶劑擴散法,此種方法制備的顆粒粒徑分布較窄，約在200300 nm。如果采用自乳化有機溶劑擴散法制備PLGA-PEI納米粒，粒徑可達100 nm左右，可成功用于小分子干擾基因siRNA的傳遞。,缺點：,由于親水性有機溶劑擴散快，pDNA容易從內(nèi)水相中泄漏，導(dǎo)致pDNA

7、包封率不高。 pDNA 在有機溶劑作用下結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化甚至降解，這將嚴(yán)重影響pDNA的活性，不利于后續(xù)基因表達。,噴霧干燥法,PLGA 固化成微納米粒后，為了保持pDNA結(jié)構(gòu)完整和生物活性，一般通過冷凍干燥法收集顆粒。但這種方法容易引起顆粒的團聚，粒徑分布不均勻，不利于細胞轉(zhuǎn)染。 噴霧干燥法將PLGA微納米乳狀液用霧化器噴霧，同時用向上流動的氮氣干燥，這種方法不僅可避免顆粒在凍干過程中發(fā)生聚集，而且可以有效去除殘留有機溶劑。,缺點：,噴霧干燥法雖然可以顯著提高pDNA 包封率，但是在干燥過程中容易導(dǎo)致pDNA 失活，基因表達強度不高。,PLGA微/納米基因載體的表面修飾,表面修飾方式：,PLG

8、A表面陽離子修飾 PLGA表面親水性修飾 PLGA表面靶向性修飾,表面陽離子修飾,表面陽離子修飾：,PLGA對pDNA的吸附效率較低，細胞轉(zhuǎn)染率相應(yīng)較低，通常采用陽離子化合物對PLGA 表面進行陽離子修飾，通過靜電作用吸附更多的pDNA，同時由于PLGA 表面帶正電荷，增強了細胞黏附和吸收，轉(zhuǎn)染率得到提高。,表面陽離子修飾：,常用的陽離子聚合物主要有十六烷基三甲基溴化銨(CATB) 、聚賴氨酸、CHS和聚醚酰亞胺(PEI) 等，其中CHS和PEI都帶有氨基基團或類似基團，可質(zhì)子化帶正電荷，從而有效的吸附帶負電的pDNA。,表面陽離子修飾：,PEI修飾PLGA有兩種方式，一種是表面物理吸附，另一

9、種是化學(xué)鍵合?；瘜W(xué)鍵合是在催化劑條件下促使 PEI 以共價鍵的方式與 PLGA結(jié)合，這種方式可以穩(wěn)定 PLGA 表面電位，增大 pDNA 吸附效率。,表面陽離子修飾：,PLGA表面陽離子修飾一方面可以明顯提高pDNA的吸附效率，另一方面粒子表面的正電位促使載體與細胞膜結(jié)合，提高轉(zhuǎn)染效率。,PLGA 表面親水性修飾,PLGA 表面親水性修飾：,PLGA 具有疏水性，對親水性藥物包封率較低。提高 PLGA對 pDNA包封率的另一途徑是通過 PLGA表面親水性基團修飾，改變表面性質(zhì)，以提高 pDNA包封率，避免 pDNA降解，增強緩釋效果。,PLGA 表面親水性修飾：,常用的親水性修飾聚合物有聚乙二

10、醇（PEG) 和聚氧乙烯 ( poly )。 研究發(fā)現(xiàn)，采用 PEG修飾 PLGA，隨著PEG 用量增加，粒徑變小，PLGA 親水性增強對pDNA表現(xiàn)出更強的親和力。,PLGA 表面親水性修飾：,PLGA 還可以與親水性聚合物形成嵌段聚合物。這類化合物極大地改善了PLGA 的親水性，同時可在水溶液中形成膠束或微/納米粒，通過物理吸附或者靜電吸附的方式結(jié)合 pDNA。,PLGA表面靶向性修飾,PLGA表面靶向性修飾：,由于PLGA微/納米基因載體靶向性傳遞效果不佳，對正常細胞毒副作用較強，導(dǎo)致在臨床應(yīng)用中受到一定的限制。經(jīng)表面靶向性修飾的 PLGA微/納米基因載體可有效提高基因傳遞的特異性，降低

11、治療的副作用，臨床應(yīng)用效果更佳。因此，PLGA表面靶向性修飾也成為基因載體研究的熱點。,PLGA表面靶向性修飾：,靶向性修飾主要憑借 PLGA 微/納米基因載體比表面積大的優(yōu)勢，在其表面偶聯(lián)靶細胞的配體或抗體 ( 如特異性配體、克隆抗體等) ，借助配體或抗體分別與細胞表面受體或抗原特異地結(jié)合，促使載體攜帶治療基因進入細胞內(nèi)，實現(xiàn)靶向轉(zhuǎn)移的目的。,PLGA微/納米基因載體的應(yīng)用研究進展,應(yīng)用：,基因治療 基因疫苗載體,進 展,PLGA 微/納米粒是一類有效的基因?qū)胼d體,它不僅可以通過不同的制備方法獲得不同粒徑大小和用途的 pDNA 載體，而且還可以通過 PLGA表面陽離子修飾和親水性修飾提高 pDNA 包封率，保護 pDNA結(jié)構(gòu)完整性，減少 pDNA體內(nèi)首過效應(yīng)，使基因在體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定的釋放和表達。,隨著研究的深入，PLGA微/納