1、靶向PCR CTC檢測技術 幫助臨床醫(yī)生更全面地評估肺癌,1,2020/8/31,Lung Cancer in Solid Tumor in China,2,2020/8/31,=,？,液態(tài)活檢 通過外周血中的腫瘤細胞或者腫瘤基因組信息來評估腫瘤,病理活檢 通過原發(fā)灶腫瘤組織來評估腫瘤,CTC ctDNA mircoRNA LNC RNA Others,傳統(tǒng)的組織細胞學檢測,液態(tài)活檢在肺癌中的應用,治療策略,事件,疑似肺癌,輔助診斷,早癌肺癌,晚期肺癌,癌癥耐藥,復發(fā)監(jiān)測,治療方案選擇,耐藥機理 新藥研發(fā),CTC的臨床應用價值,療效評估,CTC(數(shù)量） (負向富集+靶向PCR）,ctDNA (

2、基因變異）,5,2020/8/31,1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015,什么是循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell，CTC）？,腫瘤釋放如外周血中CTCs數(shù)量的多少，可間接反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài),CTC：在腫瘤發(fā)生過程中，具有干細胞特征的腫瘤細胞和不具有干細胞特征的腫瘤細胞，均由原發(fā)腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統(tǒng)稱循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell）CTC1,CTC有轉移：侵入第二器官CTCs，稱之為DTC

3、（disseminated Tumor Cell），只有由具有干細胞特征的DTC所形成的微轉移灶，逃避免疫識別才可能發(fā)展成為腫瘤遠處轉移2,什么時候可以檢測到CTC？,早期腫瘤外周血中即可檢出CTC,W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007,早期腫瘤外周血中即可檢出CTC,表達中等量FR的M109鼠肺癌細胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側面 移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個CTC細胞 移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測7個和18個CTC，隨著腫瘤逐漸增大數(shù)量呈指數(shù)上升 在腫瘤移植的前4周內(nèi)，沒有在任何組織切片中發(fā)

4、現(xiàn)到存在轉移性癌癥的跡象,CTC富集技術 密度與大小 免疫磁珠（負向富集 or 陽性富集) 微流體,CTC檢測方法,CTC檢測技術 靶向PCR 免疫熒光 普通PCR,=,+,“方法”,“收獲”,“垃圾”,蟹餌,沒水了， 我們躲不了了,放 水,負向富集,優(yōu)勢：回收率100% 劣勢：純度略低,幸好沒貪嘴， 我們逃了,10,2020/8/31,“方法”,“收獲”,“垃圾”,沒水了， 我們躲不了了,放 水,負向富集,優(yōu)勢：回收率100% 劣勢：純度略低,幸好沒吃胖， 我們逃了,網(wǎng) 篩,11,2020/8/31,CTC檢測技術 檢測原理,負向富集,靶向PCR,FR陽性靶標,肺癌細胞FR(葉酸受體）高度表

5、達 CTC：FR=1:50萬 EMT轉化不影響FR豐度 其他血細胞不表達FR,CTC回收率接近100% 磁珠富集易操作和自動化,靈敏度超高，負向富集可滿足檢測要求 信號二次放大，1個CTC信號放大1012倍 無需人工經(jīng)驗判讀，結果客觀準確 可實現(xiàn)CTC的定量,12,2020/8/31,CTC檢測靶向PCR，信號放大，保證高度敏感性,1個CTC信號放大1012倍,13,2020/8/31,CTC檢測,優(yōu)勢一：陰性富集不丟失循環(huán)腫瘤細胞,優(yōu)勢二：靶向探針特異性高,優(yōu)勢三：PCR擴增信號，確保高敏感性,優(yōu)勢四：PCR儀判斷CTC技術，避免人為誤差,14,2020/8/31,3mL血,1mL/3mL血

6、,3mL血,1個CTC/3mL血,50萬FR/1個CTC,1個CTC/1slide,100萬信號/1個FR,1個信號/1個CTC,FR靶向PCR 1個CTC細胞信號方法1012倍（萬億倍）,細胞免疫熒光 1個CTC細胞信號幾乎沒有放大,15,2020/8/31,Cell Search:正向富集+免疫熒光技術進行捕獲和鑒定,16,EpCAM 上皮細胞粘附分子 APC 異藻藍蛋白熒光染料 CK 細胞角蛋白 PE 藻紅蛋白熒光染料 DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA熒光染料）,2020/8/31,EpCAM陰性細胞中，存在大量CTC,Cell Research系統(tǒng)主要使用EpCAM（上皮

7、粘附分子）做為探針 研究證實，EpCAM陰性的細胞中也存在CTC,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,17,2020/8/31,2004,Cell Search: 乳腺癌中檢測出，但肺癌敏感性低,2011,Cell Research: 采用的抗體(EpCAM)對EMT細胞特異性差，而肺癌細胞轉移入血需要EMT的過程,19,2020/8/31,3mL血6個小時得到報告,檢測流程,20,2020/8/31,肺癌領域，CTC檢測技術對比,不同CTC計數(shù)對于肺癌診斷的特異性與敏感性,22,2020/8/31,CTC對肺癌的診斷顯著優(yōu)于一般腫瘤標志物,CTC與一般腫瘤標志物

8、對肺癌診斷的準確性（AUC值）,23,2020/8/31,單項CTC檢測的輔助診斷價值優(yōu)于多個一般腫瘤標志物聯(lián)合,AUC=0.91, P0.0001,AUC=0.76,24,2020/8/31,不同病理類型中，CTC輔助診斷價值均優(yōu)于一般腫瘤標志物,25,2020/8/31,CTC肺癌輔助診斷小結,CTC反應肺癌發(fā)生發(fā)展功能狀態(tài)，肺癌輔助診斷價值顯著優(yōu)于一般腫瘤標志物 靶向PCR CTC技術：所有肺癌敏感性提高3倍，I期肺癌提高10倍,26,2020/8/31,CTC：用于化療療效評估，先于腫瘤大小發(fā)生變化，評估腫瘤功能狀態(tài),NSCLC, 1st-line carboplatin, pacli

9、taxel (d); NSCLC, 2nd-line pemetrexed(e) Baseline CT scans were before therapy initiation and CTC measurements began at or shortly after the first treatment.,27,2020/8/31,CTC數(shù)量變化與RECIST標準基本一致,28,2020/8/31,FR靶向PCR CTC檢測與肺腺癌患者一線培美曲塞化療療效相關,培美曲塞是一種抗葉酸制劑，通過破壞細胞內(nèi)葉酸依賴性的正常代謝過程，抑制細胞復制，從而抑制腫瘤的生長 FR靶向PCR CTC檢測

10、技術特異性檢測循環(huán)腫瘤細胞表面葉酸受體含量 研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，接受一線培美曲塞化療的肺腺癌患者治療前CTC水平越高，ORR與PFS越好 葉酸受體表達量與培美曲塞治療效果正相關,29,2020/8/31,Cut off為16cu/3ml, 高表達患者的ORR明顯優(yōu)于低表達者,CTC16: 8/12（75%）患者PR，DCR 100% 8.7CTC16: 1/9（11%）患者PR,30,2020/8/31,CTC16: PFS 448天 8.7CTC16: PFS 94天,Cut off為16cu/3ml, 高表達患者的PFS明顯優(yōu)于低表達者,31,2020/8/31,總結,靶向PCR CTC檢測技術敏感度最高，反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)，可做為新