1、課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),1,一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌能利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?2,3、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌,一.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,.設(shè)置對(duì)照,3,1、實(shí)例： PCR技術(shù),啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,原因：因?yàn)闊崛獪囟?0800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)。,DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外

2、將少量DNA大量復(fù)制(PCR)的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,.篩選菌株,4,要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等； 方法： 抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng) 促進(jìn)目的菌株的生長(zhǎng) 結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過(guò)平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。,2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：,人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制其他微生物生長(zhǎng)。,5,3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,6,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖 氮源：尿素,培養(yǎng)基的氮

3、源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。,5、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,7,允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基,8,6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為 唯一氮源 的培養(yǎng)基,牛肉膏 蛋白胨 培養(yǎng)基,是,分離 尿素 細(xì)菌,判斷該 培養(yǎng)基 有無(wú)選 擇性,只生長(zhǎng)尿素細(xì)菌,生長(zhǎng)多種微生物,是,9,找規(guī)律： 1：判斷某個(gè)培養(yǎng)基是否具有選擇作用時(shí)， 應(yīng)設(shè)立_培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)照。 2：判斷所使用的培養(yǎng)基是否被雜菌污染 時(shí)，應(yīng)設(shè)立_培養(yǎng)基進(jìn)行空 白對(duì)照？,基 礎(chǔ),不接該菌種的,10,1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,利用血球計(jì)數(shù)板(血細(xì)胞計(jì)

4、數(shù)板），在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；,缺點(diǎn)：,11,2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法） 原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,12,說(shuō)明設(shè)置重復(fù)組的重要性。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重

5、復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。,13,注意事項(xiàng) 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。 為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平板中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。,14,計(jì)算公式：,每克樣品中的菌株數(shù) =（CV）M,某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106 的培養(yǎng)基中測(cè)得 平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣 品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液 的體積為0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,B,15,（三）設(shè)置對(duì)照,判斷培養(yǎng)基的制備是否合格

6、（有無(wú)被雜菌污染）：,將未接種的培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。,判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：,完全培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)成分齊全）接種后培養(yǎng) 觀察菌落數(shù)目。,主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn) 結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,16,實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。分析其原因。,原因： 土樣不同 培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),17,小結(jié)：通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn),

7、方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。,18,從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤(rùn)土壤中取樣。先鏟去表層土3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。,“微生物的天然培養(yǎng)基”,一土壤取樣,數(shù)量最大、種類最多,大約70%90%是細(xì)菌,取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。,19,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同

8、目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板,（二）樣品的稀釋,20,（三）.取樣涂布,實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度。,還少了什么嗎？,未接種的選擇培養(yǎng)基,接種的完全培養(yǎng)基,21,（四）.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,22,微生物的培養(yǎng)與觀察,23,一無(wú)菌操作 1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。 2、應(yīng)

9、在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好標(biāo)記 注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、稀釋度等。 三規(guī)劃時(shí)間,三、,24,四.結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1.通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)基沒(méi)有發(fā)揮選擇作用，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高。 2.提示：選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功,25,1.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑

10、。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。,五.課外延伸,26,27,纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過(guò)70億噸；分布植物的根、莖、葉中；,纖維素生物燃料：最有希望替代石油能源,28,一、基礎(chǔ)知識(shí),1.纖維素,纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質(zhì)。,29,土壤中某些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用。,30,2.纖維素酶 纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內(nèi)切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。

11、,一、基礎(chǔ)知識(shí),31,纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過(guò)70億噸，其中40%-60%能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，不會(huì)大量積累。,在草食性動(dòng)物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒(méi)有分解纖維素的能力。,人類可應(yīng)用分解纖維素的微生物將秸稈等廢棄物轉(zhuǎn)變成酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。,32,3、纖維素的分解,請(qǐng)用一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證此問(wèn)題,纖維素酶水解濾紙實(shí)驗(yàn),33,1U表示1個(gè)酶活力單位，是指在溫度為25，其他反應(yīng)條件，如pH等，均為最適的情況下，在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1mmol的底物所需的酶量。,底物：酶所作用和催

12、化的化合物。,纖維素酶的作用對(duì)照實(shí)驗(yàn),34,（2）纖維素分解菌的篩選,1、篩選纖維素分解菌的方法_。該方法可以通過(guò)_反應(yīng)直接篩選。,剛果紅染色法,顏色,2、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成_，但不能和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)纖維素被_分解后， 紅色復(fù)合物無(wú)法形成，出現(xiàn)以_ 為中心的_，可以通過(guò)_ 來(lái)篩選纖維素分解菌。,紅色復(fù)合物,纖維素酶,纖維素分解菌,透明圈,是否產(chǎn)生透明圈,35,實(shí)驗(yàn)原理,即：可根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈來(lái)篩選纖維素分解菌。,36,可根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈來(lái)篩選纖維素分解菌,37,練一練：,1.下列關(guān)于纖維素酶的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是,A. 纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種

13、B. 纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖 C. 纖維素酶可用于去掉植物的細(xì)胞壁 D. 葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖,38,2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是,A. 剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物 B. 剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物 C. 剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物 D. 若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說(shuō)明已篩選出了纖維素分解菌,39,(三)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),土壤取樣,選擇培養(yǎng),梯度稀釋,將樣品涂布到鑒別培養(yǎng)基,挑選菌落,什么樣的環(huán)境取樣?,培養(yǎng)的目的?,挑選什么樣的菌落?,鑒別培養(yǎng)基的特點(diǎn)? 如何鑒別?,根據(jù)：微生物對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)環(huán)境中去找；,目的：增加纖維素分

14、解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物；,剛果紅染色法,40,對(duì)比課題3與課題2實(shí)驗(yàn)流程， 說(shuō)說(shuō)它們的不同之處：,課題2土壤取樣，直接稀釋。,課題3土壤取樣，選擇培養(yǎng)， 增加纖維素分解菌濃度后，再稀釋。,41,1、纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基屬于_（固體、液體）培養(yǎng)基，原因是_,【資料二】選擇培養(yǎng),閱讀資料二“選擇培養(yǎng)”，回答以下幾問(wèn)題：,液體,沒(méi)有添加瓊脂,2、該培養(yǎng)基對(duì)微生物_（具有，不具有）選擇作用。如果具有，其選擇機(jī)制是 _,具有,能分解纖維素的微生物可利用纖維素作為碳源而大量繁殖；其他微生物繁殖被抑制,42,分布環(huán)境,1、土壤取樣：,富含纖維素的環(huán)境中,操作步驟,生物與環(huán)境的互

15、相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對(duì)提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。,原因,43,將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？,將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對(duì)聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右的腐殖土壤中。,44,提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對(duì)照,或者將纖維素改為葡萄糖。,A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？,是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無(wú)凝固劑（瓊脂）,B、你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基的作用,45,說(shuō)明：分析“

16、纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖。只不過(guò)，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。,46,旁欄思考題為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？ 在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。,指微生物的種類少了，而某些微生物的數(shù)量多了,47,將細(xì)菌涂布在只有 尿素做氮源的選擇 培養(yǎng)基上,將細(xì)菌涂布在纖維素粉做主要碳源的 選擇培養(yǎng)基上,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,篩選菌株,選擇培養(yǎng),48,按照課題

17、1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101107倍。,3.梯度稀釋,49,4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng) 基上,（1）制備鑒別培養(yǎng)基:,（2）涂布平板： 將稀釋度為104106的菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30倒置培養(yǎng)。,50,鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基,(水溶性羧甲基纖維素鈉),51,方法一：先 ，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。 方法二：在 時(shí)就加入剛果紅。,培養(yǎng)微生物,倒平板,5.剛果紅染色法,挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。,52,兩種剛果紅染色法的比較：,53,在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng) 中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素 分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基 的堿

18、性增強(qiáng)，pH升高。在培 養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如 果pH升高指示劑會(huì)變紅,剛果紅可以與纖維素形成 紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被 纖維素酶催化分解后紅色 復(fù)合物無(wú)法形成，培養(yǎng)基 上就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解 菌為中心的透明圈,觀察菌落周圍是否有著色的 環(huán)帶出現(xiàn)來(lái)鑒定尿素分解菌,觀察菌落周圍是否出現(xiàn) 透明圈來(lái)篩選纖維素分解菌,脲酶檢測(cè)法,剛果紅染色法,54,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就強(qiáng)