1、Rho激酶抑制劑 與糖尿病心肌病,河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科 李擁軍,Rho激酶的結(jié)構(gòu)和功能 Rho激酶抑制劑的藥理作用 3. Rho激酶抑制劑與心血管疾病 4. Rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病,內(nèi) 容,RhoA/ROCK,Rho為小分子鳥苷酸結(jié)合蛋白,是Ras超家族成員之一。 Rho激酶(ROCK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是最早發(fā)現(xiàn)的RhoA下游效應(yīng)器。 ROCK有兩個(gè)亞基：兩者在氨基酸序列上有65%的同源性, 其中催化結(jié)構(gòu)域的同源性高達(dá)92%。,RhoA/ROCK,Rho激酶的結(jié)構(gòu)和功能 Rho激酶抑制劑的藥理作用 3. Rho激酶抑制劑與心血管疾病 4. Rho激酶抑制劑與糖

2、尿病心肌病,內(nèi) 容,ROCK抑制劑,目前廣泛應(yīng)用的ROCK抑制劑主要有fasudil和Y-27632兩大家族。 它們是非亞基選擇性的抑制劑，既能抑制ROCK1，也可抑制ROCK2。 主要作用于ROCK催化結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)上，從而抑制ROCK的活性。 較大劑量時(shí)亦可抑制其他絲蘇氨酸激酶如PKA或PKC。,ROCK抑制劑,Fasudil 1995年在日本上市，臨床上用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血術(shù)后腦血管痙攣。是目前唯一可應(yīng)用于臨床的ROCK抑制劑。 Hydroxyfasudil是fasudil的羥化活性代謝產(chǎn)物，其對(duì)ROCK具有更高的選擇性。 Fasudil的主要不良反應(yīng)為肝功能損害(7.64%)

3、, 顱內(nèi)出血(1.63%)和低血壓(0.59%)。 但有研究者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用fasudil治療腦卒中與安慰劑比較，沒有嚴(yán)重的不良事件發(fā)生。,ROCK抑制劑,Y-27632是在細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的ROCK抑制劑。 Statins除調(diào)脂作用外，還可通過(guò)抑制類異戊二烯的生成而影響Rho蛋白的膜定位功能, 阻斷RhoA/ROCK通路，所以它具有摸擬ROCK抑制劑的效應(yīng)。 Statins呈現(xiàn)的多效性很多源于它對(duì)RhoA/ROCK通路的抑制作用。,ROCK抑制劑,ROCK抑制劑的藥理作用： （1）抑制鈣敏化效應(yīng)，擴(kuò)張血管，改善血管功能 失調(diào)。 （2）抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和粘附，減輕炎性反應(yīng)。 （3）

4、減少氧化應(yīng)激，增加eNOS的表達(dá)，促進(jìn)NO生成。 （4）抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖，減輕組織重構(gòu)。 （5）抑制肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合和一些基因的表達(dá)。,Rho激酶的結(jié)構(gòu)和功能 Rho激酶抑制劑的藥理作用 3. Rho激酶抑制劑與心血管疾病 4. Rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病,內(nèi) 容,ROCK抑制劑與心血管疾病,(1) ROCK抑制劑與動(dòng)脈粥樣硬化,ROCK抑制劑與心血管疾病,（2）ROCK抑制劑與冠心病 Masumoto等發(fā)現(xiàn)，對(duì)冠脈痙攣性心絞痛患者，冠脈內(nèi)給予Fasudil 可明顯減輕Ach誘發(fā)的冠狀動(dòng)脈收縮，防止胸痛發(fā)作，而對(duì)血壓沒有明顯影響。,ROCK抑制劑與心血管疾病,Otsuka等人在

5、為穩(wěn)定型心絞痛患者行冠脈造影時(shí)，首先冠脈內(nèi)給予硝酸甘油200g，而后給予fasudil 30mg靜脈輸注，分別測(cè)量管腔狹窄處直徑，發(fā)現(xiàn)fasudil明顯擴(kuò)張狹窄處的管徑，其效果優(yōu)于硝酸甘油。,ROCK抑制劑與心血管疾病,在日本進(jìn)行的一個(gè)多中心期臨床試驗(yàn)評(píng)估了口服fasudil對(duì)于勞力型心絞痛患者的療效。結(jié)果顯示長(zhǎng)期服用fasudil可以改善患者的運(yùn)動(dòng)耐力，且存在量效關(guān)系。同時(shí)患者對(duì)藥物的耐受性良好，未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良事件。 新近，Kikuchi等人已將血循環(huán)中中性粒細(xì)胞上ROCK的活性作為心絞痛診斷和病情評(píng)估的指標(biāo)。,ROCK抑制劑與心血管疾病,（）ROCK抑制劑與高血壓病 在高血壓大鼠模型中，

6、短期給予Y-27632，能夠以劑量依賴的方式顯著地降低血壓，這提示ROCK的激活包含在高血壓的發(fā)病機(jī)制中。 研究發(fā)現(xiàn)將fasudil應(yīng)用于高血壓病的患者，可以增加患者的前臂血流量，降低前臂血管阻力，而對(duì)正常人血管則沒有擴(kuò)張作用。,ROCK抑制劑與心血管疾病,（）ROCK抑制劑與肺動(dòng)脈高壓(PAH) 研究證實(shí)：ROCK介導(dǎo)的ECs功能失調(diào)、VSMCs 的過(guò)度收縮和增殖、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等都參與了PAH的形成。 Fukumoto等人給9例嚴(yán)重PAH患者靜點(diǎn)fasudil (30mg for 30min)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)fasudil能夠降低肺動(dòng)脈壓力，增加心臟指數(shù)，明顯降低肺血管阻力，且未引起低血壓等付作用

7、。,ROCK抑制劑與心血管疾病,小結(jié)： 大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明：ROCK抑制劑在防治心血管疾病方面具有巨大的潛力，已成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。 有更多的研究正在證實(shí)ROCK抑制劑的用途及其安全性。 ROCK抑制劑的高選擇性將會(huì)減少其相關(guān)的毒付作用。目前正在研發(fā)亞基選擇性ROCK抑制劑。,Rho激酶的結(jié)構(gòu)和功能 Rho激酶抑制劑的藥理作用 3. Rho激酶抑制劑與心血管疾病 4. Rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病,內(nèi) 容,ROCK與糖尿病并發(fā)癥,ROCK與糖尿病心肌病,RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在2型糖尿病大鼠心肌纖維化中的作用,研究背景,糖尿病心肌病是糖尿病一種獨(dú)特的心臟并發(fā)癥。這與糖尿病患者心

8、血管疾病的高發(fā)病率和高病死率密切相關(guān)。 心肌舒張功能障礙是其最早出現(xiàn)的臨床表現(xiàn),最終可發(fā)展為心力衰竭。 心肌纖維化是其主要的病理改變之一，在糖尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用。,對(duì)糖尿病心肌病目前尚缺乏有效的治療措施，更好地了解其發(fā)病機(jī)制并發(fā)展新的治療藥物是非常必要的。 國(guó)內(nèi)對(duì)糖尿病心肌病的研究主要應(yīng)用1型糖尿病模型，對(duì)2型糖尿病模型的研究較少。 研究?jī)?nèi)容集中在形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞因子水平上，對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究很少。,研究背景,研究目的,目前，RhoA/ROCK通路在糖尿病心肌纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，ROCK的下游信號(hào)分子尚不完全肯定。 研究目的：在細(xì)胞水平和整體動(dòng)

9、物水平，探討RhoA/ROCK、JNK和TGF1/Smad通路在糖尿病心肌纖維化中的作用以及相互關(guān)系。 有可能為糖尿病心肌病確定有效的預(yù)防和治療靶點(diǎn)。,第一部分,RhoA/ROCK通路在高糖誘導(dǎo)大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成中的作用,體外研究,細(xì)胞培養(yǎng),CF proliferation was evaluated using MTT assay. The data are means SD. n=6; P0.01 vs NG group. *P0.05, *P0.01 vs HG group.,結(jié) 果,The mRNA expression of type-I procollagen, RO

10、CK1 and JNK was evaluated by RT-PCR. n=3; The mRNA expression of type-I procollagen was significantly upregulated in HG group.,結(jié) 果,Immunocytochemical staining for type-I procollagen. Magnification is 400.,結(jié) 果,Accumulation of type-I collagen in media was determined by ELISA. The data are means SD. n=

11、6; P0.01 vs NG group. *P0.05, *P0.01 vs HG group.,結(jié) 果,結(jié) 果,The phosphorylation of MYPT1 was measured by western blot analyses. n=3; P0.01 vs NG group. *P0.01 vs. HG group.,結(jié) 果,JNK activity and c-jun protein expression were measured by Western blot analyses. n=3; P0.01 vs NG group. *P0.01 vs HG group.

12、,結(jié) 果,The protein expression of TGF1 and the phosphorylation of Smad2/3 was measured by Western blot analyses. n=3; P0.01 vs NG group. *P0.01 vs HG group.,結(jié) 論,結(jié) 論,高糖激活了RhoA/ROCK通路，介導(dǎo)了心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成。ROCK特異性抑制劑法舒地爾有效地抑制了高糖誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成。 高糖環(huán)境中，JNK和Smad2/3是ROCK的下游信號(hào)分子，RhoA/ROCK通路介導(dǎo)的胞質(zhì)信號(hào)部分地通過(guò)JNK和Smad2/3

13、轉(zhuǎn)入核內(nèi)，從而調(diào)控著相關(guān)的基因表達(dá)。,第二部分,RhoA/ROCK通路在2型糖尿病大鼠心肌纖維化中的作用及法舒地爾對(duì)心肌的保護(hù)效應(yīng),在體研究,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié) 果,結(jié) 果,結(jié) 果,Masson staining, Magnification, 400,結(jié) 果,TEM, Magnification, 6000,結(jié) 果,SABC staining for type-I collagen (A) and type-III collagen (B) Magnification, 400,結(jié) 果,The mRNA expression of type-I procollagen, type- procollagen was evaluated by RT-PCR. n=6; P0.01.,結(jié) 果,The mRNA expression of ROCK1, JNK and TGF1 was evaluated by RT-PCR. n=6;,結(jié) 果,The phosphorylation of MYPT1 and JNK was measured by Western blot analyses. n=6; P0.01.,結(jié) 果,The protein levels of c-jun and TGF1, as we