1、抗體制備技術(shù),是指無性繁殖細(xì)胞系，是由單一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的一簇細(xì)胞純系。在這個(gè)家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。,克隆(clone),1、多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）：用 一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物，可刺激 機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同 抗體。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的 混合物。 2、單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAb）：由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無交叉反應(yīng)性。,抗體的制備技術(shù)經(jīng)歷了三代： 第一代抗體是傳統(tǒng)的抗

2、體制備方法即利用抗原免疫動(dòng)物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibody）； 第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對(duì)抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因工程抗體(genetic engineering antibody)。,Ab1,Ab3,Ab4,單克隆抗體,Ab1,抗血清,Ab1 Ab2 Ab3 Ab4,Ab3,Ab4,普通抗血清（多克隆抗體）,單克隆抗體和多克隆抗體產(chǎn)生區(qū)別示意圖,抗體制備技術(shù),一、多克隆抗體制備 （一）免疫原的制備 （二）免疫動(dòng)物 （三）免疫血清

3、的純化 （四）免疫血清的鑒定 （五）免疫血清的保存 二、單克隆抗體制備 （一）單克隆抗體制備原理,抗體制備技術(shù),（二）單克隆抗體制備的技術(shù)要點(diǎn) （三）影響雜交瘤技術(shù)的因素 （四）單克隆抗體的應(yīng)用 三、基因工程抗體技術(shù) （一）人源化抗體 （二）小分子抗體 （三）雙特異性抗體 （四）抗體庫技術(shù),多克隆抗體制備,一、免疫原的制備 免疫原（immunogen）指能刺激機(jī)體免疫系 統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的抗原最 重要的性質(zhì)是免疫原性（immunogenicity） 免疫原天然抗原、人工 合成抗原； 蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原；,（一）、細(xì)胞性抗原制備： 綿羊紅細(xì)胞（SRBC）- 溶血素； 細(xì)菌

4、- 抗菌抗體（動(dòng)物免疫血清） （二）、可溶性抗原制備： 指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。作為免疫原需要由細(xì)胞的破碎、提取與純化 1）細(xì)胞的破碎（物理法、化學(xué)法）,反復(fù)凍融法 超聲破碎法 自溶法 酶處里法 表面活性劑處理法,2）提取與純化： 超速離心分離是一種根據(jù)分離物質(zhì)的比重特點(diǎn)，通過差速或梯度密度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開的方法，只適宜少數(shù)大分子物質(zhì)的分離。,選擇性沉淀選擇某抗原理化特性，采用相應(yīng)沉淀劑或溶液環(huán)境。 核酸去除 鹽析沉淀法 有機(jī)溶劑沉淀法 高分子聚合物沉淀法 例： 50%飽和硫酸銨鹽溶液可沉淀析出學(xué)清球蛋； 8%12%PEG6000可沉淀IgG。,鹽析法沉淀抗原的機(jī)理,超濾法利

5、用孔徑大小不同的特制薄膜對(duì)不同分子大小的抗原物質(zhì)進(jìn)行濾篩。 層析法 凝膠過濾 離子交換 親和層析 電泳（略）,凝膠過濾層析( 分子篩)的作用機(jī)理,親和層析的作用機(jī)理,3）鑒定： 鑒定純化蛋白的含量、相對(duì)分子的質(zhì)量、 純度以及免疫學(xué)活性。 蛋白的含量定氮（紫外光280nm等） 分子的質(zhì)量電泳、質(zhì)譜 蛋白的純度電泳等 免疫學(xué)活性免疫雙擴(kuò)散、免疫印跡,抗原性質(zhì)分析結(jié)果,（三）半抗原性免疫原的制備 1.載體選擇 常用載體：蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物。 （1）蛋白質(zhì)類：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最為常用。 （2）多肽類聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一類

6、良好的載體，常用的有多聚賴氨酸。 （3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生良好的抗體。,2.連接方法 半抗原與載體的連接有物理法和化學(xué)法。 物理法 是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附載體主要有PVP和CMC等； 化學(xué)法 是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選用不同的方法進(jìn)行連接。,根據(jù)半抗原擁有的化學(xué)基團(tuán)不同，連接方法主要有以下幾類： 帶游離氨基或羧基以及二種基團(tuán)皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵，帶氨基的半

7、抗原則可與載體羧基縮合。 帶有羥基、酮基、醛基的半抗原：不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羥胺法等方法將之轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌锖蟛拍芘c載體連接。 帶有酚基的半抗原，可用一氯醋酸鈉法或重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。,（五）免疫佐劑 某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。,佐劑的種類 佐劑一般包括以下幾類： 無機(jī)佐劑： 如氫氧化鋁、明釩等 生物性佐劑： 如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂

8、毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細(xì)胞因子等； 人工合成佐劑： 如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）； 油劑： 如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等； 納米佐劑,弗氏佐劑（Freunds adjuvant）,分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種： 前者是由油劑（礦物油或花生油）和乳化劑（羊毛脂或吐溫-80）按1：11：5比例混合而成； 后者由弗氏不完全佐劑加卡介苗組成。在免疫動(dòng)物時(shí)，先將弗氏佐劑與抗原等比混勻，制成“油包水”乳化液。,佐劑與抗原混合乳化的方法： 研磨法 和攪拌混合法兩種,2. 佐劑的免疫生物學(xué)作用 增強(qiáng)抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成

9、持久或強(qiáng)的免疫原； 增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原刺激的反應(yīng)性，提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度； 改變抗體類型，使產(chǎn)生抗體由IgMG型轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG型； 引起或增強(qiáng)遲發(fā)性超敏反應(yīng)。,3. 佐劑的作用機(jī)制 佐劑的作用機(jī)制歸納起來主要有如下幾種： 可增強(qiáng)抗原的表面積和改變抗原活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性。 佐劑與抗原混合一起注入機(jī)體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲(chǔ)存庫，延長抗原在局部組織的滯留時(shí)間，有利于抗原的緩慢釋放。 增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細(xì)胞吞噬），促進(jìn)對(duì)抗原的處理，刺激淋巴細(xì)胞增生，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。,二、免疫動(dòng)物,為獲取高質(zhì)量的抗體，除了需制備高純度

10、的抗原外，還需選擇適宜的動(dòng)物和設(shè)計(jì)有效可行的免疫方案，如抗原的劑量、劑型、注射途徑、注射次數(shù)、注射間隔和接種動(dòng)物的年齡均與免疫效果密切的關(guān)系。,1.免疫動(dòng)物的選擇 選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)考慮以下因素： 抗原來源與動(dòng)物種屬的關(guān)系?？乖膩碓磁c免疫動(dòng)物種屬差異越遠(yuǎn)，其免疫源性越強(qiáng)，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。 動(dòng)物個(gè)體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動(dòng)物（以雄性為佳）；抗體需要量少時(shí)，選用家兔、豚鼠和雞等小動(dòng)物；抗體需要量大時(shí)，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動(dòng)物。 抗原性質(zhì)與動(dòng)物種類。,2.免疫方法 選定動(dòng)物后，在免疫過程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。 (

11、1) 免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強(qiáng)弱、動(dòng)物的個(gè)體狀態(tài)和免疫時(shí)間來確定。首次免疫時(shí)，劑量不宜過大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。,(2) 免疫途徑與免疫間隔時(shí)間 免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對(duì)于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。 免疫間隔時(shí)間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時(shí)間尤為重要，一般以1020天為佳，二次后間隔時(shí)間一般為710天，若間隔時(shí)間太長，則刺激減弱，抗體效價(jià)不高。,3. 動(dòng)物采血 采集免疫血清前，要預(yù)先測試抗體效價(jià)測定，若效價(jià)達(dá)到要求，應(yīng)在末次免疫后一周及時(shí)采血，否則抗體效價(jià)會(huì)下降。 (1) 頸動(dòng)脈采血法

12、 (2)心臟采血法 (3)靜脈采血法,圖1 頸動(dòng)脈分離圖,三、免疫血清的純化,1. 特異性抗體的純化 免疫原不純，導(dǎo)致產(chǎn)生雜抗體混雜于抗血清中。雜抗體的除去可采用： (1) 親和層析法 （2）吸附法,2. IgG類抗體的純化 IgG類抗體的純化常用方法有鹽析法、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等方法。 (1) 鹽析法：硫酸銨鹽析常用于-球蛋白提取，經(jīng)三次沉淀后提取的-球蛋白大多屬于IgG。,(2) 凝膠過濾法：各種蛋白質(zhì)成分的分子量大小不同，在通過凝膠介質(zhì)時(shí)，洗脫速度也不同，從而達(dá)到分離目的。 血清蛋白的分級(jí)分離常用凝膠過濾法進(jìn)行，按分子大小可分為三組：第一組包括IgM和一些脂蛋白；第二組主要

13、是IgG和較少量的IgA、IgD、IgE等球蛋白；第三組主要白蛋白、血清粘蛋白、鐵傳遞蛋白等。,在凝膠過濾柱上血清蛋白的層析示意圖 (M=IgM, G=IgG, A=IgA),(3) 離子交換層析法純化IgG IgG作為一種-球蛋白，在血清蛋白中帶電荷較最少，用離子交換層析法易于分離。DEAE-Sephadex A-50是一弱堿性離子交換劑，常用于免疫球蛋白的純化。 血清中的-球蛋白屬于中性蛋白，其余均屬酸性蛋白。在pH7.27.4的環(huán)境中, 酸性蛋白被DEAE-Sephadex A-50吸附，-球蛋白不被吸附而得以純化。該技術(shù)純化IgG簡便，不損壞抗體結(jié)構(gòu)和特異性。,圖3 在DEAE-纖維素

14、上人血清蛋白的層析示意圖 (M=IgM, G=IgG, A=IgA),(4) 親和層析法純化 葡萄球菌A蛋白（SPA）或連球菌G蛋白具有與IgG Fc段結(jié)合的能力，可用親和層析來分離IgG。 分離時(shí)可采用兩種類型的親和層析柱即SPA或G蛋白交聯(lián)至Sepharose 4B制成的親和層析柱?？寡逋ㄟ^層析柱時(shí)，IgG被吸附，而非特異性蛋白則未能結(jié)合被洗脫除去，然后改變洗脫條件，使IgG從層析上解離從而達(dá)到純化目的 。,圖4 親和層析純化IgG基本過程示意圖,四、免疫血清的鑒定 1. 效價(jià)的測定：顆粒性抗原可采用凝集試驗(yàn)，可溶性抗原常用雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA等方法。 2. 特異性的鑒定：抗體特

15、異性鑒定常用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法,3. 純度的鑒定： 抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳等方法。 IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS-PAGE結(jié)果應(yīng)有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進(jìn)一步純化。 4. 親和力的鑒定：測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗(yàn)等。,單抗親合常數(shù)的測定： 單抗親合常數(shù)測定采用非競爭酶免疫試驗(yàn)法： 1）先確定在某一抗原濃度時(shí)抗體可以達(dá)到飽和； 2）以該抗原濃度為實(shí)驗(yàn)條件，飽和時(shí)的OD值作為OD-100，找出OD-50時(shí)

16、的抗體濃度和相應(yīng)的pp65抗原濃度； 3)根據(jù)公式Ka= n-1 計(jì)算McAb的Ka值。 2(nAbt-Ab t) t代表測定時(shí)的溫度； n=Abt/Abt； Abt表示抗原濃度較高的Amax的一半； Abt表示抗原濃度較低的Amax的一半。 對(duì)于單克隆抗體，一般親合力要求107L/mol，好的單抗多大于109 L/mol。,五、免疫血清的保存,1、4保存（6個(gè)月） 2、低溫保存（-70 -20 ，5年） 3、真空干燥保存（5 10年） 注意點(diǎn)：保存前需經(jīng)除菌 保存液含防腐劑 避免反復(fù)凍融（分裝）,第二節(jié) 單克隆抗體的制備 Preparation of monoclone antibody,單

17、克隆抗體（McAb）,是由只識(shí)別單一抗原決定簇的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。,理化性狀高度均一 效價(jià)高 只與一種抗原表位發(fā)生反應(yīng)、生物活性單一 具有高度特異性又易于大量制備,克隆選擇學(xué)說的模式圖,單克隆抗體制備方法：,雜交瘤技術(shù) EBV技術(shù),雜交瘤單克隆抗體?,通過抗原致敏B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)克隆化培養(yǎng)所形成單克隆雜交瘤細(xì)胞克隆，所分泌的針對(duì)抗原上某一抗原表位的純的抗體，具有生物活性單一，理化性質(zhì)高度均一，產(chǎn)量高等特點(diǎn)。,一、雜交瘤技術(shù)的基本原理,一、雜交瘤技術(shù)的原理及流程,二、單克隆抗體制備技術(shù),主要材料 細(xì)胞融合前準(zhǔn)備 細(xì)胞融合 抗體的初篩和克隆化 雜交瘤細(xì)胞凍存與復(fù)

18、蘇 單克隆抗體的批量生產(chǎn) 單克隆抗體的純化與鑒定,（一）主要材料：,培養(yǎng)液 1.RPM1640培養(yǎng)液 FCS 10% 谷氨酰胺 2mmol/L 青霉素 100IU/ml 鏈霉素 100Ug/ml 2.DMEM培養(yǎng)液,H（Hypoxanthine, H）次黃嘌呤； A（Aminopterin）氨基喋呤； 葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑 T (Thymidine, T) 胸腺嘧啶核苷； “核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNA。 。,HAT培養(yǎng)基,淋巴細(xì)胞：在培養(yǎng)液中不能生長，5-7天死亡； 骨髓瘤細(xì)胞：在培養(yǎng)液中不能生長，5-7天死亡； DNA合成的主要途徑：被A阻斷； DNA合成的替代

19、途徑：由于HGPRT缺乏，不能利用 H、T而被阻斷。,HAT選擇作用,PEG是最常用的細(xì)胞融合劑。 PEG可能的作用機(jī)理： PEG導(dǎo)致細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合。PEG的細(xì)胞融合作用完全是隨機(jī)發(fā)生的。一般選用分子量4000 的PEG作為細(xì)胞融合劑。不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同。,細(xì)胞融合劑,（二）細(xì)胞融合前準(zhǔn)備,1. 免疫方案 顆粒性抗原 可溶性抗原 2. 飼養(yǎng)細(xì)胞 3. 骨髓瘤細(xì)胞 4. 免疫脾細(xì)胞,常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1SP20X63 Ag8.653,骨髓瘤細(xì)胞系選擇要點(diǎn)：,動(dòng)物品系相同 不產(chǎn)生免疫球蛋白重鏈和輕鏈 對(duì)HAT敏感 融

20、合后產(chǎn)生穩(wěn)定性高的雜交瘤細(xì)胞,1 選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)應(yīng)是渾圓、透亮、均一、排列整齊。 2 避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞。 切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80或液氮及干冰中。,培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞,1. 細(xì)胞融合 2. HAT選擇雜交瘤,(二) 細(xì)胞融合，選擇雜交瘤,（三）抗體初篩與克隆化,以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。 常用的方法有: 1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。 2.RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。 3.FACS(流式細(xì)胞術(shù))用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測。,（四）雜交瘤的凍存和克隆化,1. 克隆

21、化方案 用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。 (1) 有限稀釋法 (2) 軟瓊脂法,2. 雜交瘤細(xì)胞的凍存,細(xì)胞凍存液: 50小牛血清 40不完全培養(yǎng)液 10DMSO(二甲亞砜),（五）單克隆抗體的大量生產(chǎn),大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：1.體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為1060gml，如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。 2.體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。,（六）單克隆抗體的鑒定,1.抗體特異性的鑒定： 2.McAb的Ig類與亞類的鑒定： 3. McAb中和活性的鑒定： 4.McAb親和力的鑒定：,抗體的純化

22、：,硫酸銨沉淀 離子交換層析 SPA-sepharose 親和層析柱分離,影響雜交瘤技術(shù)的因素,1、試劑與器材 用前必須經(jīng)嚴(yán)格的篩選，尤其血清、融合劑 2、培養(yǎng)技術(shù) 防止污染，細(xì)胞培養(yǎng)的嫻熟技能 3、早期克隆化 避免無關(guān)細(xì)胞克隆的過度生長，但又應(yīng)避免 克隆細(xì)胞的丟失。,第四節(jié) 基因工程抗體技術(shù) Genetic Engineering Technique,是指應(yīng)用NDA重組及蛋白工程技術(shù)對(duì)編碼抗體的基因按不同的需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體。,基因工程抗體(重組抗體),基因工程抗體技術(shù),用DNA重組和蛋白工程技術(shù)對(duì)已有的單抗進(jìn)行改造。 包括人源化抗體、小分子抗體、雙價(jià)特

23、異性抗體和抗體融合蛋白等的制備。 用抗體庫技術(shù)篩選、克隆新的單抗。,一、人源化抗體,1. 將小鼠的CDR序列移植到人抗體可變區(qū)框架中，產(chǎn)生的抗體稱為CDR移植抗體。 2.將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體。,從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體。 特點(diǎn)： 1.減少了鼠源性抗體的免疫原性 2.保留了親本抗體特異性結(jié)合抗 原的能力。 。,1.嵌合抗體 (chimeric antibody),嵌合抗體 (chimeric antibody),指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)決定簇（CDR）序列改換成鼠源