1、流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備,FCM的樣品制備包括單分散細(xì)胞懸液制備技術(shù)，細(xì)胞生物學(xué)特征標(biāo)記技術(shù)及熒光染色技術(shù)，F(xiàn)CM是對細(xì)胞或細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和某些功能進行定量測定，并可以根據(jù)細(xì)胞亞群的特點性質(zhì)對其進行分類的技術(shù)。 FCM的實驗對象是單細(xì)胞或單細(xì)胞核的懸液，在FCM技術(shù)中制備出合格的單細(xì)胞懸液是非常重要的環(huán)節(jié)，這些單細(xì)胞懸液主要來源于單層細(xì)胞、血液、脫落細(xì)胞、實體組織及石蠟包埋組織等。,一、單層培養(yǎng)細(xì)胞分散為單個細(xì)胞 貼壁的單層培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備 操作步驟： 1、將單層培養(yǎng)細(xì)胞(對數(shù)生長期)中的舊培養(yǎng)液倒掉。 2、加入少量0.25%胰酶，消化細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察，見細(xì)胞稍變圓時，立即終止消化（

2、假如含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基），收集細(xì)胞，離心后去上清，PBS液洗滌細(xì)胞一次，離心去掉上清液，約留0.5ml細(xì)胞懸液，用振蕩器使細(xì)胞分散。 3、如果不是及時上機檢測，則需要對細(xì)胞進行固定，常規(guī)固定液為70%乙醇，然后保存于4冰箱中。,（二）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備 操作步驟： 1、離心去除舊培養(yǎng)液，PBS液洗滌細(xì)胞一次，離心去掉上清液，約留0.5ml細(xì)胞懸液，用振蕩器使細(xì)胞分散。 2、如果不是及時上機檢測，則需要對細(xì)胞進行固定，常規(guī)固定液為70%乙醇，然后保存于4冰箱中。,二、實體組織單分散細(xì)胞的制備 新鮮實體組織 新鮮實體組織是手術(shù)或活檢后根據(jù)檢測目的而采取的樣品，此樣品應(yīng)及時進行適當(dāng)

3、的保存處理，如及時用固定劑或低溫對組織進行保存，以避免由于室溫過高、放置時間過長而造成組織自溶，影響檢測結(jié)果。,新鮮實體組織單細(xì)胞懸液制備方法如下： 酶消化法 機械法 剪碎法 網(wǎng)搓法 研磨法 化學(xué)試劑處理法,酶消化法 酶對實體組織分散作用原理主要有三方面： 一是可以破壞組織間的膠原。 二是可以水解組織細(xì)胞的緊密連結(jié)裝置的蛋白性物質(zhì)。 三是可以水解組織間的粘多糖物質(zhì)。 酶消化法是實體組織分散為單細(xì)胞的主要方法，常用的酶類試劑有： 蛋白酶類，(如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，鏈蛋白酶和中性蛋白酶等)都能夠釋放所有組織中的細(xì)胞； 胰酶，能水解脂鍵和肽鍵； 膠原酶，能降解幾種分子類型的膠原； 溶菌酶，能水解糖

4、蛋白和肽的糖苷鍵； 彈性蛋白酶，能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖維，可用于解離血管、心臟和肝臟的細(xì)胞。,為使組織細(xì)胞分散下來，應(yīng)用酶學(xué)方法必須注意條件的選擇和影響因素： 酶需要溶解于適當(dāng)?shù)娜芤褐?，而這種溶液不致于造成 酶效價降低 注意組織在消化液中的消化時間 注意酶活性的PH值 注意酶的適用濃度 隨時注意影響酶活性的其他因素 各種酶的分散程度都有一定的限制性，特別是在進行免疫標(biāo)記實驗時，酶處理可能改變細(xì)胞膜的成分，從而影響細(xì)胞亞群的區(qū)分。應(yīng)指出，用于組織分散的很多酶是不夠純的，不僅含有一種占主導(dǎo)的酶，而且在不同程度上也混有其他污染物質(zhì)，它們的活性可能有利于組織分散，也可能對組織的結(jié)構(gòu)或功能

5、產(chǎn)生不利的影響。,酶學(xué)方法的一般程序： 將適合于酶消化的組織置于離心管中。 將選好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化組織的試管中。 一般消化20-30分鐘(恒溫37C或室溫)，消化期間要間接振蕩或吹打。 終止消化，收集細(xì)胞懸液，以尼龍網(wǎng)(200目)過濾，除去大團塊，以低速離心除去細(xì)胞碎片。 將制備好的單細(xì)胞進行流式細(xì)胞術(shù)分析或保存。,機械法 機械法分裂實體組織包括：用剪刀剪碎或用鋒利的解剖刀剁碎，用勻漿器勻漿，用細(xì)注射針頭抽吸細(xì)胞以分散細(xì)胞，采用網(wǎng)搓法同樣也能獲得大量的細(xì)胞，機械法易造成細(xì)胞懸液中細(xì)胞碎片，所以機械法常與其他方法配合使用。,常用的幾種機械法制備過程如下： 剪碎法： 將組織塊放入平

6、皿中，加入少量的鹽水。 用剪刀將組織剪至勻漿狀。 加入10ml生理鹽水。 用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中。 離心沉淀1000prm3-5分鐘，再用生理鹽水洗三次，每次以短時低速離心沉淀(500-800prm)去除細(xì)胞碎片。 以300目尼龍網(wǎng)過濾除去細(xì)胞團塊。 70%冰乙醇固定，放入4冰箱。,網(wǎng)搓法： 將100目銅網(wǎng)扎在小燒杯上。 把剪碎的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直到將組織搓完。 用300目的尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液除去大的團塊 收集細(xì)胞懸液，離心沉淀1000prm，5分鐘。 70%乙醇固定，置4冰箱備用。,研磨法 準(zhǔn)備一只70ml組織研磨器 將

7、組織剪碎至小塊。 放入組織研磨器中，加入1-2ml生理鹽水。 轉(zhuǎn)動研棒，研至勻漿即可。 加入生理鹽水10-20ml，沖洗研器。 收集細(xì)胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀500-800prm，1-2分鐘，再用生理鹽水洗三次，離心沉淀。,化學(xué)試劑處理法 化學(xué)試劑處理法的主要原理是將細(xì)胞間起粘連作用 的鈣鎂離子置換出來，從而使細(xì)胞分散下來。 試劑配制： 0.2%EDTA配制 EDTA0.2g溶解后，加入Hanks液100ml，封裝高壓消毒，置0-4保存。 胰酶加EDTA配制 胰酶0.25g+PBS(PH7.0)200ml，濃度0.125%，EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml，濃度

8、0.2%。 各取40ml混合，分裝置冰箱保存，用時過濾既可。,實驗步驟： 將組織切成薄片放入試管。 加入EDTA液5ml，室溫，半小時，棄之。 加入胰酶+EDTA液5-10ml，在37恒溫水浴30分鐘，間斷振蕩3-5次。 用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀1000prm，5分鐘，再以生理鹽水洗2-3次，離心500-800prm，1-2分鐘。 70%乙醇固定置冰箱中被檢。,實驗證實，用化學(xué)試劑處理組織導(dǎo)致細(xì)胞成活率降低，細(xì)胞產(chǎn)額較低，細(xì)胞碎片和細(xì)胞叢結(jié)的量不穩(wěn)定，因此，化學(xué)試劑處理方法不單獨使用，可與其他方法聯(lián)合使用。 機械法常常造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，較低的細(xì)胞產(chǎn)量，為使細(xì)胞碎片不影響FCM檢測結(jié)果，

9、需采用適當(dāng)?shù)姆椒ǔニ槠虮M量減少碎片。 酶學(xué)法對實體腫瘤的分散解聚是較理想的，但是會對所測化學(xué)成分造成不良影響，所以根據(jù)使用目的去選擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法，才能獲得理想的樣品和更好的FCM結(jié)果。,注意事項： 新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時進行保存，以免組織在室溫下放置時間過長，造成細(xì)胞自溶導(dǎo)致DNA降解，影響FCM測定結(jié)果。 根據(jù)實驗?zāi)康倪x用最佳的細(xì)胞固定方法，以免由于固定劑的原因，造成FCM檢測結(jié)果的不穩(wěn)定。 酶學(xué)法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時間、pH值、濃度等方面對酶消化法的影響。 需注意不同的組織選用適當(dāng)?shù)姆椒?，如富于?xì)胞的腫瘤(淋巴瘤、視神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腦瘤、未分化癌、髓

10、樣癌以及一些軟組織肉瘤)不一定要用酶學(xué)或化學(xué)法，往往用單獨的機械法就可以收到大量單分散細(xì)胞。 在使用酶學(xué)方法時，要重視酶的選用，如含有大量結(jié)締組織的腫瘤，如食管癌、乳癌、皮膚癌等，用膠原酶為好，因為膠原酶具有在Ca2、Mg 2存在或在血清狀態(tài)下不發(fā)生活性降低的特征。,實驗方法： 石蠟包埋組織在切片機上切取40-50m厚的組織片3-5片。 將切取的組織片放入試管中。 加入二甲苯5-8ml脫蠟(在室溫下)，1-2天，視石蠟脫凈與否，可更換一次二甲苯，蠟脫凈后棄去二甲苯。 水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度的酒精5ml，每步10分鐘，去乙醇，加入蒸餾水3-5ml，10分鐘后棄之。 消

11、化：加入2ml 0.5%胃蛋白酶(pH值1.5-2.0)置37恒溫水浴中消化30分鐘，消化期間每隔10分鐘振蕩一次。,石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備,消化30分鐘后，立即加入生理鹽水終止消化。 經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，未消化完的組織片可以二次消化。 收集細(xì)胞懸液，離心沉淀1500prm，以生理鹽水漂洗1-2次，離心沉淀1500prm，再以生理鹽水漂洗1-2次，離心沉淀500-800prm，去碎片。 制備好的單細(xì)胞懸液作涂片，AO染色在熒光顯微鏡下觀察，應(yīng)為完整細(xì)胞核，核發(fā)出黃綠色熒光。 單細(xì)胞樣品1106細(xì)胞/ml，加入熒光染液溴化乙啶(EB)或碘化丙啶(PI)1ml，置0-4冰箱30分鐘，經(jīng)30

12、0目尼龍網(wǎng)過濾后上機檢測。,注意事項： 一定將石蠟從組織中脫干凈，檢驗是否將石蠟脫凈的方法是，棄去二甲苯，加入100%乙醇，如無絮狀物浮起，即視為石蠟已脫凈，反之則沒有脫凈。 消化時間不可過長，以免造成已釋放出的細(xì)胞核被消化掉。 切片不可過薄或過厚，過薄則碎片增多，影響流式分析結(jié)果，過厚造成脫蠟不凈或脫蠟時間過長，一般以40-50m為宜。,二、血液單細(xì)胞樣品的制備 血液是天然的單細(xì)胞分散細(xì)胞懸液，血中的細(xì)胞成分在生理狀態(tài)下呈分散的游離狀態(tài)，它是流式細(xì)胞分析的最合適的樣品，全血中含有紅細(xì)胞，白細(xì)胞和血小板三種有形成分，但流式細(xì)胞的檢測是以某一群細(xì)胞為測定對象，因此在檢測前須將所測的某群細(xì)胞分離出

13、來，下面分別介紹幾種血細(xì)胞的分離制備方法。, 淋巴細(xì)胞的制備 取肝素抗凝血2.0ml，用生理鹽水2ml將全血稀釋至4ml。 先將3ml人淋巴細(xì)胞分離液放入另一個離心管，然后將稀釋后的血沿試管內(nèi)壁緩緩加入到分離液面之上，勿用力過大，以免造成血液與分離液混合，保持清晰的分層狀態(tài)。 離心2000prm，30分鐘，室溫18-20，離心后可見試管內(nèi)的血液清楚的分為4層，上層為血漿層，中層為分離液層(淋巴細(xì)胞所處的位置在血漿層與分離液層中間)，底層為紅細(xì)胞，紅細(xì)胞上為粒細(xì)胞。 用吸管將上層與中層之間的淋巴細(xì)胞吸出，收集到另一支離心管，用生理鹽水稀釋至10ml，離心洗滌2次，每次均以1500prm, 10分

14、鐘，棄上清后即得到純度較高的淋巴細(xì)胞，但可有少量的單核細(xì)胞。 70%冰乙醇固定，置4冰箱保存。, 粒細(xì)胞的制備 用淋巴細(xì)胞分離液對細(xì)胞進行分層。 粒細(xì)胞的比重較淋巴細(xì)胞稍大，因此經(jīng)分離液分離后的粒細(xì)胞，分層于紅細(xì)胞之上，分離液的底部。 以吸管慢慢將粒細(xì)胞層吸出，置另一支離心管內(nèi)，以5ml的Hanks液洗滌三次，每次離心沉淀1500prm，10分鐘。 在吸取粒細(xì)胞的同時常附帶一些紅細(xì)胞，因此需將紅細(xì)胞去除，加入1.0ml低滲溶液，30-40秒。 再以Hanks液洗滌2次，即可獲得純度大于95%以上的粒細(xì)胞。, 單核細(xì)胞制備 1. 取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1,加入3.0ml生理 鹽水

15、將血稀釋,均在無菌條件下操作。 2.1640培養(yǎng)液10.0ml,放入培養(yǎng)瓶內(nèi),將稀釋血加入 培養(yǎng)液中,混勻,與培養(yǎng)瓶接觸面要大。 3.放入37恒溫箱內(nèi)孵育30-40分鐘,取出培養(yǎng)瓶 ,將血傾倒掉,用生理鹽水將培養(yǎng)瓶輕輕沖洗一次,以去掉殘留的血液,這時培養(yǎng)瓶壁上貼附了大量的單核細(xì)胞,因為單核細(xì)胞具有短時培養(yǎng)期內(nèi)貼附快的特點 ,而其他細(xì)胞沒有這個特性,所以利用這一特性進行短時培養(yǎng)可獲得較純的單核細(xì)胞。,4.將粘附于培養(yǎng)瓶壁上的單核細(xì)胞消化下來,用0.25%胰酶消化1015分鐘,室溫下,并不斷搖震,以促使細(xì)胞脫落下,單核細(xì)胞的粘附力很強,用酶消化往往獲得細(xì)胞數(shù)少,目前亦采用機械的方法,用一橡皮刷,伸

16、入培養(yǎng)瓶在瓶壁上輕擦,將細(xì)胞刮取下,但切勿用力過大,造成細(xì)胞損傷過多。 5.脫落下來的細(xì)胞移入離心管,離心沉淀1500prm,5分鐘,再以生理鹽水漂洗23 次,每次離心800prm,2分鐘,以去除碎片雜質(zhì)。 6.將細(xì)胞涂片,以丫啶橙染色,置熒光顯微鏡下觀察形態(tài)和純度。 7.將細(xì)胞以70%乙醇固定,置0-4冰箱保存?zhèn)錂z。,三、脫落細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備 在臨床實際工作中，可收集到大量自然脫落的細(xì)胞，這些細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)過簡單的處理，就可得到較好的單分散細(xì)胞懸液，所以是流式細(xì)胞術(shù)檢測的天然樣品，下面介紹幾種常見的脫落細(xì)胞樣品制備方法。 宮頸脫落細(xì)胞懸液的制備 1.首先用生理鹽水沖洗宮頸表面的分泌物,以海棉

17、輕拭宮頸表面,將海棉中吸附的脫落細(xì)胞洗脫到20ml生理鹽水中。 2.收集細(xì)胞懸液,以1500prm離心沉淀,用生理鹽水洗滌2次,每次5分鐘,棄上清后加入70%乙醇3ml固定備檢。,食管脫落細(xì)胞懸液的制備 1.將食管拉網(wǎng)器上的細(xì)胞洗脫到10ml生理鹽水中,以1500prm離心沉淀,再用生理鹽水洗滌2次,離心500-800prm1-2分鐘,棄上清。 2.調(diào)整細(xì)胞數(shù)在1X106/ml,可進行標(biāo)記染色上機,如不馬上檢測可用70% 的冰乙醇固定保存。 3.在標(biāo)記染色前如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有團塊聚集，可用0.5%胃蛋白酶(PH1.5-2.0)在37水浴箱中消化5-10分鐘，振蕩分散為單細(xì)胞懸液。, 胸腹水脫落細(xì)胞的制備 1.抽取胸腹水200-300ml，加入抗凝劑(肝素或枸櫞酸鈉)5ml，放入容器中置4冰箱靜置6-12小時，棄上清。 2.留取沉淀液10-20ml，吸入試管內(nèi)，以生理鹽水洗三次，以1500prm離心沉淀5分鐘。 3.離心沉淀后加入冷枸櫞酸緩沖液5ml，在室溫下放置20分鐘。 4.用