1、病毒滴度的測(cè)定,1,2020/9/4,2,原理(重點(diǎn))：適當(dāng)稀釋的病毒懸液與長(zhǎng)成單層的宿主細(xì)胞混合，在細(xì)胞上覆以營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等固體或半固體介質(zhì)，由于瓊脂的限制，病毒只能感染并破壞臨近的細(xì)胞，造成細(xì)胞溶解而形成空斑，每個(gè)空斑由一個(gè)病毒顆粒造成，計(jì)算空斑數(shù)量再乘以稀釋倍數(shù)即可得知原來的病毒感染單位的濃度。,空斑形成單位法測(cè)定病毒滴度,空斑形成單位（Plaque Forming Units, PFUs),3,空斑顯現(xiàn)原理(掌握)：空斑形成后，經(jīng)中性紅活細(xì)胞染色，活細(xì)胞顯示紅色，而空斑區(qū)細(xì)胞不著色，形成不染色區(qū)域。,空斑形成單位法測(cè)定病毒滴度,4,Procedures,5,適用條件(熟悉)：凡是能在

2、細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的病毒都可以采用空斑形成法測(cè)定病毒滴度。,空斑形成單位法測(cè)定病毒滴度,6,中性紅,(掌握),2020/9/4,7,(熟悉),2020/9/4,8,(了解),2020/9/4,9,(了解),空斑形成單位試驗(yàn)技術(shù)舉例 p51-52 防止瓊脂凝固； Hanks液？ 雙抗？ 5% CO2,2020/9/4,10,空斑形成單位的計(jì)算 (重點(diǎn)),2020/9/4,11,(掌握),2020/9/4,12,2020/9/4,13,(熟悉),2020/9/4,14,CCID50,ID50,LD50,(重點(diǎn)),2020/9/4,15,(熟悉),2020/9/4,16,5% CO2培

3、養(yǎng)箱,(熟悉),2020/9/4,17,CCID50,TCID50,(熟悉),2020/9/4,18,病毒液 CPE孔數(shù) 無CPE 累 計(jì) 出現(xiàn)CPE孔 稀釋度 孔數(shù) CPE孔數(shù) 無CPE孔數(shù) 所占的% 10-1 8 0 27 0 100（27/27） 10 -2 8 0 19 0 100（19/19） 10 -3 7 1 11 1 91.6 （11/12） 10 -4 3 5 4 6 40（4/10） 10 -5 1 7 1 13 0.7（1/14） 10 -6 0 8 0 21 0（0/21）,Reed-Muench法計(jì)算CCID50,CPE(陽性)孔累計(jì)數(shù)由下向上累積 無CPE(陰性)孔

4、累計(jì)數(shù)由上向下累積,(難點(diǎn)、重點(diǎn)),19,CCID50,(難點(diǎn)、重點(diǎn)),2020/9/4,20,Calculation of TCID50,Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well),2020/9/4,21,Karber法計(jì)算CCID50,(難點(diǎn)、重點(diǎn)),22,lgCCID50=L+d(s-0.5) L: 病毒的最低稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù) L=lg10-1 = -1 d：稀釋系數(shù)，即組距 d=lg10-1 = -1 S：CPE(陽性)孔比率總和 lgCCID50=(-1) + (-1)(3

5、.375-0.5) =-3.875 CCID50=10-3.875/0.1ml,23,ID50 和 LD50 的計(jì)算與CCID50完全相同(掌握) lgCCID50=L+d(s-0.5) ID50 計(jì)算，S：感染比率總和； LD50 計(jì)算，S：死亡比率總和；,24,(掌握),2020/9/4,25,血凝試驗(yàn)的基本原理(掌握),紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象(血凝現(xiàn)象) 紅細(xì)胞凝集抑制 (紅細(xì)胞與抗體結(jié)合，失去血凝) 血凝滴度/血凝單位,血凝試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度,2020/9/4,26,2020/9/4,27,2020/9/4,28,干擾滴定測(cè)定病毒滴度,2020/9/4,29,小結(jié) 主要介紹空斑形成單位法、50%終點(diǎn)法、血凝試驗(yàn)和干擾滴定法測(cè)定病毒滴度的原理及其方法； 重