1、第10章 基因診斷,Contents,第一節(jié) 基因診斷概念、應(yīng)用技術(shù) 第二節(jié) 基因診斷方法及實(shí)例,基因診斷： 利用分子生物學(xué)技術(shù)從DNA水平檢測(cè)人類遺傳性疾病的基因缺陷，又稱DNA分析法。 傳統(tǒng)的疾病診斷：表現(xiàn)型基因型 基因診斷：基因型表現(xiàn)型（逆向診斷）,基因診斷的優(yōu)勢(shì)和意義：,1 不受材料來源影響-微量 外周血、活體穿刺組織、孕婦羊水絨毛、男性精斑等 2 癥狀前診斷 尤其對(duì)于一些延遲顯性疾病如Huntingtong舞蹈病 3 產(chǎn)前基因診斷 避免遺傳病患兒出生，提高人口質(zhì)量,第一節(jié) 基 因 診 斷 技 術(shù),Southern-blot,Northern-blot,基 因 診 斷 技 術(shù),斑 點(diǎn)

2、雜 交,點(diǎn)樣,Probe-32P,檢測(cè),A B,1 2 3 4,斑點(diǎn)雜交 or等位基因特異性寡核苷酸_,基 因 診 斷 技 術(shù),熒光原位雜交,基 因 診 斷 技 術(shù),熒光原位雜交,基 因 診 斷 技 術(shù),聚合酶鏈反應(yīng),基 因 診 斷 技 術(shù), 多重PCR,在一個(gè)PCR體系中加入數(shù)對(duì)PCR引物，覆蓋區(qū)域不重疊 用于檢測(cè)同一基因多個(gè)外顯子的缺失,E1 E2 E3,PCR為基礎(chǔ)的診斷技術(shù),基 因 診 斷 技 術(shù), RT-PCR,以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA 用于研究基因表達(dá) 使微量mRNA迅速擴(kuò)增，提高mRNA檢出的靈敏度,實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）,PCR-DGGE,

3、基 因 診 斷 技 術(shù), PCR-SSCP （Single Strand Conformation Polymorphism）,單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長(zhǎng)度的單鏈DNA電泳遷移率的不同。據(jù)此，可用于DNA中單個(gè)堿基的替代、微小的缺失或插入的檢測(cè)。,基 因 診 斷 技 術(shù),- primer - 32P-dNTP摻入 PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物 變性 單鏈DNA 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3 4 5 自顯影 1為正常 結(jié)果分析 2、4、5為純合患者 3為雜合子 .,PCR-SSCP技術(shù)應(yīng)用舉例：,測(cè)序：,dHPLC,基 因 診 斷 技 術(shù),基 因 診 斷 技

4、術(shù),生 物 芯 片,篩查基因突變的方法比較,檢測(cè)已知基因突變的方法,點(diǎn)突變：酶切，測(cè)序，ASO，測(cè)序 缺失、插入： Southern-blot ，測(cè)序,多重PCR 重復(fù)：酶切，測(cè)序,第二節(jié) 基因診斷方法及實(shí)例,直接診斷直接檢測(cè)致病基因的突變 基因突變類型缺失、點(diǎn)突變、重復(fù)、插入等,間接診斷應(yīng)用DNA多態(tài)為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖 分析，確定待測(cè)者是否得到帶有致病的染色體，從而間接地作出診斷 利用遺傳標(biāo)記DNA多態(tài)RFLP、VNTR、SNP,DNA分析中常用的遺傳性多態(tài)性標(biāo)記：,限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)：較大片段

5、的插入缺失，或堿基變異導(dǎo)致限制酶切點(diǎn)消失出現(xiàn)酶切后產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段。 可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(Variable number tandem repeats, VNTR)：重復(fù)序列首尾相連，重復(fù)單位6-25bp小衛(wèi)星DNA；2-6bp 微衛(wèi)星DNA；酶切PCR擴(kuò)增后可產(chǎn)生長(zhǎng)度差異；等位基因多，雜合度高。 單核苷酸多態(tài)性(Single nucleiotide polymorphism, SNP)：?jiǎn)蝹€(gè)核苷酸的替代、缺失或插入，基因組中含量豐富。,二、直接基因診斷及實(shí)例,直接檢測(cè)致病基因本身的異常。通常使用基因本身或鄰近DNA序列作為探針，進(jìn)行Southern雜交，或通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（或酶切），

6、以檢測(cè)基因點(diǎn)突變、缺失、插入等異常性質(zhì)。 主要適用于已知基因異常疾病的診斷。,直接基因診斷 突變型遺傳病的直接基因診斷,e.g. 鐮形細(xì)胞貧血的Gene診斷-點(diǎn)突變 A.Southern blot MstI識(shí)別CCTGAGG 突變?yōu)镃CTGTGG后 不能識(shí)別， 限制酶切片段長(zhǎng)度發(fā)生變化,B.等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO） （Allele-specific-oligonucleotide ）,已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡核苷酸探針，32P標(biāo)記，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。 Normal Gene Probe與正常 穩(wěn)定雜交 Mutation S Gene Probe與異常S 穩(wěn)定雜交,斑點(diǎn)雜交結(jié)果

7、,2代2的基因型？,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,1） 地中海貧血的基因診斷,基因不同程度的缺失可引起不同類型的地中海貧血。,直接基因診斷 缺失型遺傳病的直接基因診斷,Southern blot 檢測(cè)結(jié)果：,/ /- /- - - /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺4,14kb,10kb,缺失型遺傳病的直接基因診斷,Southern-RFLP 檢測(cè)地貧地中海貧血 珠蛋白基因部分缺失,DMD的基因診斷,DMD屬XR DMD基因是最大的致病基因，有79個(gè)外顯子 DMD基因突變主要以缺失為主，可涉及基因的不同部位,E1 E2 E3,缺失

8、型遺傳病的直接基因診斷,病例,外顯子,1 2 3 4 5 6 7 8,Pm 3 43 50 13 6 47 60 52,bp,535,113,缺失型遺傳病的直接基因診斷,三、間接基因診斷方法及實(shí)例,當(dāng)致病基因雖然已知，但其異常性質(zhì)未知時(shí)，或疾病Gene本身尚未知時(shí)，主要通過DNA多態(tài)的連鎖分析間接地作出診斷。,應(yīng)用條件：遺傳標(biāo)記與易感Gene在染色體上連鎖 遺傳標(biāo)記：基因組DNA多態(tài)，如RFLP,VNTR,SNP等。 連鎖分析過程： 1、首先確定家系中先癥者致病基因與DNA多態(tài)等位片段間的連鎖關(guān)系； 2、檢測(cè)家系成員DNA多態(tài)性結(jié)果 3、分析待檢者是否遺傳到帶有致病基因的染色體,間接推斷 患病

9、情況。,連鎖分析,間接基因診斷,1 Southern blot-RFLP診斷(PKU),PAH基因兩側(cè)有Msp1酶切位點(diǎn); 用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb 兩種等位片段; 以PAH cDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交,間接基因診斷,患者為19kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖 其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。 II2為23kb和19kb片段的雜合子,為表型正常的致病基因攜帶者。,間接基因診斷,2 成年型多囊腎病的診斷,例：成年型多囊腎病APKD，AD ，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，

10、腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。 APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證實(shí)APKD Gene與珠蛋白基因3端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3HVR）緊密連鎖，因此，可以通過RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷。,間接基因診斷,以3HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的基因組DNA進(jìn)行Southern Blot,基因組DNA,PvuII酶切,DNA片段,變性,轉(zhuǎn)膜,探針,變性,雜交,結(jié)果分析,間接基因診斷,1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb,間接基因診斷,結(jié)果分析,患者（I1、II1和II2）有3.4kb

11、片段,說明致病基因與3.4kb片段連鎖，并按孟德爾方式遺傳。II5不含3.4kb片段，產(chǎn)前診斷正常。,間接基因診斷,間接基因診斷,甲型血友病FVIII Bcl I多態(tài)片段 已知甲型血友病XR， 獲得家系成員基因組DNA, PCR產(chǎn)物142bp 經(jīng)BclI酶切， 產(chǎn)物：142bp、99 bp、43bp， 電泳結(jié)果分析。,甲型血友病診斷（PCRRFLP）,間接基因診斷,II199bp其母(I2)的99bp片段與缺陷基因連鎖，142bp片段與正?；蜻B鎖；其父(I3)142bp片段與正?；蜻B鎖 II2為攜帶者； II3為正常.,142bp,99bp,1 2,1,2,3,III,1,間接基因診斷-甲

12、型血友病系譜2,1,1,結(jié)果分析 1）先癥者II1具有99bp片段而發(fā)病，該片段來自母親。 2）II2有142bp/99bp，為雜合子。142bp來自父親，為正常片段，99bp片段是來自母親而成為攜帶者。 3）1為99bp片段； 如果是男性為患者（99bp片段來自母親）； 如果是女性為攜帶者（來自父母雙方）。,間接基因診斷,PCR-VNTR,單核苷酸多態(tài)性（SNP）,SNP：發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代 根據(jù)SNP在基因中的位置，分為： 基因編碼區(qū)SNP 基因周邊SNP 基因間SNP 在人類基因組中每100300個(gè)核苷酸就有一個(gè)SNP,單體型分析,有時(shí)用一種酶和一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(RFLP,ST

13、R)不能提供可供分析的信息，需采用一種以上的酶結(jié)合幾個(gè)多態(tài)信息分析。 采用同一條染色體上與疾病基因緊密連鎖的多個(gè)位點(diǎn)的DNA多態(tài)片段的組合類型進(jìn)行分析，該分析方法稱單體型分析（Haplotyping),間接基因診斷,- 單體型連鎖分析：PAH基因的HindIIISph I多態(tài)片段,患兒(II1)及其父母(I1, I2)均為雜合子 無法分析,患兒的父親(I1) 為純合子 無法分析,- 單體型連鎖分析(2)：PAH基因的Hind III Sph I 多態(tài)片段,與缺陷基因相連鎖的單體型為：,H S,H S,H S,4.0 7.0,4.2 7.0,II 2為正常， II 3為攜帶者,分析： 患兒1從母

14、親和父親各獲得一個(gè)7.0kb突變型,從Hind 酶切結(jié)果看出：正常同胞3為純合4.0kb,也是sph7.0kb純合體,故母親H4.0kbS7.0kb 構(gòu)成單體型，母親7.0kb為突變型，因此，母親H4.0kbS7.0kb為突變單體型。 患兒1為Hind 4.2/4.0kb雜合體，故父親H 4.2kb S 7.0kb 為突變單體型； 母親H4.2kb、S9.7kb和父親H4.0kb、S7.0kb 為正常單體型。 2兩個(gè)單體型分別為H4.2kb、S9.7kb（母）和H4.0kb、S 7.0kb（父）正常個(gè)體； 3兩個(gè)單體型分別為H 4.0kb S 7.0kb（母）和H4.0kb、S7.0kb（父）

15、攜帶者。,間接基因診斷,基因診斷應(yīng)用,1、臨床診斷：在遺傳病的臨床癥狀出現(xiàn)后所作的診斷。如，新生兒篩查 1）一般手段：病史采集、癥狀、體征、常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢查。 2）特殊手段：系譜分析、核型分析、生化分析、DNA分析 2、癥狀前診斷：在遺傳病的臨床癥狀出現(xiàn)前所作的診斷。如，huntington舞蹈病 3、產(chǎn)前基因診斷：判斷胎兒的染色體或基因等是否正常。 4、植入前基因診斷：胚胎是否遺傳正常,產(chǎn)前基因診斷對(duì)象,1)夫婦之一有染色體畸變，特別是平衡易位攜帶者，或夫婦核型正常，但曾生育過染色體病患兒的孕婦； 2)35歲以上的高齡孕婦； 3)夫婦之一有先天性代謝缺陷、開放性神經(jīng)管畸形，或生育過這種患兒的孕婦； 4)X連鎖遺傳病基因攜帶者孕婦； 5)有原因不明的習(xí)慣性流產(chǎn)史的孕婦；羊水過多的孕婦； 6)夫婦之一有致畸接觸史的孕婦（病毒感染、藥物、煙酒）； 7)具