1、基因敲除技術(shù)介紹,基 因 敲 除,1.基因敲除簡介 2.基因敲除方法及其原理 3.基因敲除應(yīng)用,基因敲除簡介,中文名稱：基因敲除或基因剔除 英文名稱：gene knock-out; gene knockout 定義1：將細(xì)胞基因組中某基因去除或使基因失去活性的技術(shù)。去除原核生物細(xì)胞、真核生物的生殖細(xì)胞、體細(xì)胞或干細(xì)胞基因組中的基因等。廣義的基因敲除包括某個或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因調(diào)控序列的敲除以及成段基因組序列的敲除。 所屬學(xué)科：生物化學(xué)與分子生物學(xué)（一級學(xué)科）；方法與技術(shù)（二級學(xué)科） 定義2：將細(xì)胞基因組中某基因去除或使基因失去活性的方法。敲除的基因用以觀察生物或細(xì)胞的表型變化，

2、是研究基因功能的重要手段。 所屬學(xué)科：細(xì)胞生物學(xué)（一級學(xué)科）；細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)（二級學(xué)科） 定義3：在基因組水平上改變或破壞靶基因的結(jié)構(gòu)，使其功能完全喪失的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 所屬學(xué)科：遺傳學(xué)（一級學(xué)科）；發(fā)育遺傳學(xué)（二級學(xué)科）,基因敲除簡介,定義：通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。,1234567,123456790,8,90,基因敲除,基因敲除方法及其原理,通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用dna同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的插入突變和rnai，它們同樣可以達(dá)到基因

3、敲除的目的。,基因敲除技術(shù),同源重組法 插入突變法 rnai法,利用基因同源重組進(jìn)行基因敲除,利用同源重組構(gòu)建基因敲除動物模型的基本步驟 （以小鼠為例）,7,a.基因載體的構(gòu)建 把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的dna 分子都重組到帶有標(biāo)記基因的載體上，成為重組載體。,bes 細(xì)胞的獲得： 現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細(xì)胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細(xì)胞也有使用。 .同源重組： 將重組載體通過一定的方式導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞(es cell)中，使外源dna與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的dna序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達(dá),選擇篩選已擊中的細(xì)胞：

4、目前常用的方法是正負(fù)篩選法（pns法），標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法以及pcr法。其中應(yīng)用最多的是pns法。 表型研究： 通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達(dá)到研究目的基因的目的。,f得到純合體： 由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進(jìn)行至少兩代遺傳。,基因敲除是80年代后半期應(yīng)用dna同源重組原理發(fā)展起來的。 該方法通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的，克服了隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)

5、的方法。 直到現(xiàn)在，運(yùn)用基因同源重組進(jìn)行基因敲除依然是構(gòu)建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。,利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除,此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。 基因捕獲法是最近發(fā)展起來的利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除的新型方法 。,技術(shù)原理：,插入載體的選擇： 根據(jù)細(xì)胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。 1)逆轉(zhuǎn)率病毒可用于動植物細(xì)胞的插入； 2)植物細(xì)胞中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的t-dna轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子比較常用； 3）噬菌體可用于細(xì)菌基因敲除。,基因捕獲法的優(yōu)點(diǎn)

6、面對人類基因組計(jì)劃產(chǎn)生出巨大的功能未知的遺傳信息，傳統(tǒng)的基因敲除方法顯得有些力不從心。因此，基因捕獲法應(yīng)運(yùn)而生，利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機(jī)插入突變的es細(xì)胞庫，節(jié)省大量篩選染色體組文庫以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用，更有效迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析。 基因捕獲法的缺點(diǎn) 只能剔除在es 細(xì)胞中表達(dá)的基因。 用基因捕獲法進(jìn)行基因剔除的另一個缺點(diǎn)是無法對基因進(jìn)行精細(xì)的遺傳修飾。,rnai引起的基因敲除,rnai基因敲除的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用 .比用同源重組法更加簡便，周期大大縮短。 .對于哺乳動物，如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基 因，可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中利用rnai技術(shù)研究它的功能。

7、 .由于rnai能高效特異的阻斷基因的表達(dá)，它成為研究信號傳導(dǎo)通路的良好工具。 .rnai還被用來研究在發(fā)育過程中起作用的基因，如可用rnai來阻斷某些基因的表達(dá)，來研究他們是否在胚胎干細(xì)胞的增殖和分化過程中其起著關(guān)鍵作用。,基因敲除技術(shù)的應(yīng)用,建立生物模型 在基因功能，代謝途徑等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技術(shù)就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進(jìn)行相關(guān)的研究。這些模型可以是細(xì)胞，也可以是完整的動植物或微生物個體。最常見的是小鼠。,.提供廉價的異種移植器官 眾所周知，器官來源稀少往往是人體器官移植的一大制約因素，而大量廉價的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。這是因?yàn)楫愒?/p>

8、生物的基因會產(chǎn)生一些能引起人體強(qiáng)烈免疫排斥的異源分子，如果能將產(chǎn)生這些異源分子的基因敲除，那么動物的器官將能用于人體的疾病治療，這將為患者帶來具大的福音。,疾病的分子機(jī)理研究和疾病的基因治療 通過基因敲除技術(shù)可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對機(jī)體的影響。這無論是對了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標(biāo)都有重大的意義。 對于日益威脅人體健康的腫瘤而言，它的產(chǎn)生多是抑癌基因突變的結(jié)果，因此，可應(yīng)用基因敲除技術(shù)制備人類癌癥的鼠模型。同時，應(yīng)用rnai技術(shù)可以特異地殺傷帶有異?；虻哪[瘤細(xì)胞。 基因敲除技術(shù)還可用于治療遺傳病，包括去除多余基因或修飾改造原有異常基因以達(dá)到治療目的。,免疫學(xué)中的應(yīng)用 同異源器官移植相似，異源的抗體用于人體時或多或少會有一定的免疫排斥，使得人用抗體類藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用受阻。而如果將動物免疫分子基因敲除，換