1、第六章 獸藥殘留檢測技術(shù),第八節(jié) 激素類藥物殘留的危害分析與檢測方法,一、概述,獸用激素包括皮質(zhì)激素、同化激素。 天然皮質(zhì)激素主要有可的松及氫化可的松。這類皮質(zhì)激素有較強的糖代謝及抗炎等作用,而對水、鹽代謝的作用較弱,所以稱其為糖皮質(zhì)激素。臨床上應(yīng)用廣泛。通常所說的皮質(zhì)激素即指這類激素。 近年來,為了提高療效,降低副作用,而合成了一系列的糖皮質(zhì)激素衍生物。如潑尼松(強的松)與氫化潑尼松(強的松龍),糖原異生作用更強,對水鹽平衡的影響更弱。較小劑量常用于補充腎上腺皮質(zhì)功能缺乏,較大劑量則能抑制免疫過程中的多個環(huán)節(jié)，緩解炎癥。,1、糖皮質(zhì)激素,糖皮質(zhì)激素的主要作用是能降低機體對內(nèi)外環(huán)境各種刺激的反

2、應(yīng)性,具體表現(xiàn)在抗炎、免疫抑制、抗毒素和抗休克等方面。還可使血糖升高,蛋白質(zhì)分解加強,使血淋巴細胞、嗜酸性細胞減少,紅細胞、嗜中性粒細胞、血小板增高等。 糖皮質(zhì)激素主要用于以下疾病:各種炎癥、嚴(yán)重感染及傳染病、過敏性疾病、風(fēng)濕病、休克、代謝疾病以及引產(chǎn)。 皮質(zhì)激素會引起水分在體內(nèi)滯留,增加肉的重量,因而在畜牧業(yè)中有可能當(dāng)作增重劑而被濫用。 濫用這類藥物后,肉品感官上多汁、肉瘦。因此飼養(yǎng)場中用皮質(zhì)激素作催長劑，屬于違禁使用。,潑尼松,別名強的松,不溶于水,微溶于乙醇。應(yīng)避光、密封保存。 具有抗炎及抗過敏作用,還能促進蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)變?yōu)樘?減少葡萄糖的利用,因而使血糖及肝糖原增加,尿中可出現(xiàn)糖尿,同

3、時增加胃液分泌,促進食欲。 其水、鈉潴留及促進鉀排泄作用比可的松小,抗炎及抗過敏作用較強,副作用較小,故比較常用。 主要用于各種急性嚴(yán)重細菌感染、嚴(yán)重的過敏性疾病、風(fēng)濕、類風(fēng)濕、腎病綜合征、支氣管哮喘、各種腎上腺皮質(zhì)功能不足癥、濕疹等。,地塞米松,別名氟美松,不溶于水,溶于無水乙醇。應(yīng)遮光保存。 抗炎及控制皮膚過敏的作用比潑尼松龍更顯著,而對水、鈉潴留和促進鉀排泄作用較弱。 目前地塞米松的應(yīng)用愈來愈廣泛,有取代潑尼松等其他合成皮質(zhì)激素的趨勢。 肌注后吸收快,狗和鼠分別于0.5h和6h達血藥峰濃度。大部分在肝內(nèi)被代謝成羥基地塞米松及其葡萄糖苷結(jié)合物而滅活。,氟輕松,氟輕松為白色結(jié)晶性粉末,無臭,

4、不溶于水,溶于乙醇。應(yīng)遮光、密封保存。 氟輕松為外用皮質(zhì)激素中療效最顯著而副作用較小的一種,涂敷于局部對皮膚、黏膜的炎癥(搔癢及皮膚過敏反應(yīng)等有效。不但療效高,而且顯效快,使用很低濃度即有明顯作用,止癢作用尤其突出。 本品主要用于各種皮膚病,如濕疹、過敏性皮炎、皮膚瘙癢等。對局部化膿創(chuàng)面,需同時配合新霉素等抗生素。,倍他米松,倍他米松為白色結(jié)晶性粉末,無臭,味苦,幾乎不溶于水,溶于乙醇。 本品含有多種鹽類,如磷酸鈉鹽、二丙酸鹽、醋酸鹽等。均應(yīng)遮光保存。 內(nèi)服吸收良好,生物利用度約為72%,血漿蛋白結(jié)合率64%,半衰期5.6h,4.8%的藥量自尿液排出。 牛肌注80g/kg,停藥二日,肝臟中母藥

5、殘留量為5.47.8g/kg; 停藥八日,肝臟中母藥殘留量為10.9g/kg,腎臟、肌肉和脂肪中母藥殘留量分別為2.3g/kg、3.9g/kg和4.4g/kg。,2、同化激素,例如：雄激素能明顯地促進蛋白質(zhì)合成(同化作用),能使肌肉發(fā)達,體重增加;同時氨基酸分解減少(異化作用),使尿素生成減少降低氮質(zhì)血癥。但使用雄激素?？沙霈F(xiàn)男性化現(xiàn)象,因而限制了它的應(yīng)用。 近年來人工合成的一些衍生物,其雄激素作用大為減弱,而同化作用則保留或增強,這些衍生物稱同化激素。 同化激素主要用于蛋白質(zhì)同化或吸收不足、降低亢進和損失過多等情況。 畜牧業(yè)中使用同化激素(非治療用途，提高胴體品質(zhì)、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率),可

6、以很快產(chǎn)生顯著和直接的經(jīng)濟效益,因此對生產(chǎn)者有很大的吸引力。,同化激素類藥物,去氫睪酮、去氫甲睪酮、醋酸氯地孕酮、氯睪酮、乙烯雌醇、醋酸甲羥孕酮、醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮、諾甲醋孕酮、去甲睪酮、司坦唑醇、醋酸群勃龍等,醋酸甲羥孕酮,作用與黃體酮相似,孕激素活性強,無雌激素和雄激素活性,有抗雌激素作用。 內(nèi)服、注射均有效。內(nèi)服在胃腸道吸收,在肝內(nèi)降解。肌內(nèi)注射后23天血藥濃度達到峰值。血藥峰值越高,藥物清除越快。肌注150mg后69個月血中才檢不出藥物。 小牛肌注復(fù)方制劑(24mg醋酸甲羥孕酮、100mg苯甲酸雌二醇、200mg癸酸去甲睪酮)后停藥2天,血漿中醋酸甲羥孕酮濃度為1g/kg,14

7、天時降至30pg/kg。尿液在數(shù)天內(nèi)都能檢出,14天時醋酸甲羥孕酮濃度為37pg/kg。腎組織殘留相對較高,故作為殘留檢測的靶組織。,醋酸美侖孕酮,別名醋酸甲烯雌醇,為合成的避孕藥。 內(nèi)服時孕激素作用約為黃體酮的75倍,無雌激素和雄激素活性,具有顯著排卵抑制作用。 小母牛用藥后,母藥和代謝物主要由糞便排出。停藥6h,肝、脂肪、腎和肌肉組織中的殘留量分別為915g/kg、78g/kg、1.21.8g/kg和0.51g/kg。脂肪、肝、腎和肌肉中母藥殘留量分別占總殘留的80%、37%、30%和45%。 美國FDA規(guī)定休藥期48h,但歐盟禁止使用。,去甲睪酮,牛注射去甲睪酮后,脂肪中殘留能被檢出,并

8、持續(xù)73天;尿中殘留低于1g/kg。 內(nèi)服后脂肪中殘留未被檢出,但尿中殘留可檢出。,醋酸甲地孕酮,本品為孕激素對垂體促性腺激素的釋放有一定的抑制作用,但比左炔諾孕酮和炔諾酮為弱。不具有雌激素和雄激素樣活性,但有明顯抗雌激素作用。與雌激素合用,抑制排卵。 動物致畸試驗表明對家兔具有死胎率增加和致畸作用。 口服后生物半衰期明顯比左炔諾孕酮為短,大部分代謝產(chǎn)物以葡萄糖醛酸酯形式排出。,3、危害,對人體危害較為嚴(yán)重的主要有甾類同化激素(包括雌酮、雌二醇、睪酮、皮質(zhì)酮等物質(zhì))及2-受體激動劑(苯乙胺類)。這些存在于環(huán)境介質(zhì)中的激素量雖然很小,但大多具有生物富集作用,容易通過食物鏈在人體中富集,對人類及其

9、他生物產(chǎn)生極其嚴(yán)重的危害。 主要產(chǎn)生各種慢性、蓄積性毒性,如致癌、致畸、致突變等三致性毒性以及免疫毒性、發(fā)育毒性和生態(tài)毒性等。2-受體激動劑類藥物可產(chǎn)生急性毒性作用。 危害多具有隱蔽性,易造成實質(zhì)性危害而難以逆轉(zhuǎn)。,糖皮質(zhì)激素的危害,對人體的危害主要表現(xiàn)為抑制腎上腺皮質(zhì)功能,使腎上腺皮質(zhì)萎縮。 另外,過多攝入,可使人產(chǎn)生多毛癥、滿月臉以及免疫力下降等毒副作用。 對敏感型的個體可造成血管擴張,血壓降低而引起休克,甚至死亡。,同化激素的危害,目前,同化激素對環(huán)境的污染已引起了社會各界的普遍關(guān)注。 長期攝入同化激素，即使含量甚微，也會導(dǎo)致機體代謝紊亂、發(fā)育異常,且多數(shù)激素類物質(zhì)具有潛在的致癌作用。

10、歐盟(原歐洲經(jīng)濟共同體)從1988年起,禁止所有同化激素用于動物的促生長目的,并制定了嚴(yán)格的監(jiān)測措施。 我國從20世紀(jì)90年代起,也陸續(xù)開始對用于促生長目的的同化激素禁止使用,并已開展了相關(guān)的監(jiān)測工作。 但是,在利益驅(qū)動下,在世界范圍內(nèi),同化激素仍在被大量濫用。就殘留的危害和引起的爭議而言,同化激素與抗生素并列為最重要的獸藥殘留。,雄性激素及其同化激素的危害,進人人體和動物體后,對其生殖功能產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,甚至可能造成某些物種的絕種。 通過食物鏈進行富集,在人體首先引起內(nèi)分泌失調(diào),危害生殖系統(tǒng),易出現(xiàn)生殖器病變。 對男性的危害：表現(xiàn)為睪丸萎縮、胸部擴大、早禿、肝腎功能障礙或肝臟腫瘤。 對女性的

11、危害：可引起女性的不孕、早產(chǎn)、流產(chǎn)、月經(jīng)不調(diào)或女性男性化(肌肉增生、毛發(fā)增多)等現(xiàn)象。 目前,在局部地區(qū)已開始出現(xiàn)人類生存危機現(xiàn)象,如發(fā)達國家約有20%的家庭沒有子女,而睪丸癌的患者明顯增加。,對其他動物的危害,激素污染對人類以外的其他動物影響更為顯著,如魚、鳥和哺乳動物的大量死亡,雌雄異變,生育和發(fā)育紊亂,免疫力下降等現(xiàn)象,可能均與此有關(guān)。 1980年左右,美國一造紙廠廢水排出口下游的雌性魚雄性化,且雄性化后的魚與原先正常雌性魚進行交尾,原來正常雄性魚出現(xiàn)超雄化,并表現(xiàn)為攻擊性交尾行動。 在日本,發(fā)現(xiàn)有雌海螺長有雄海螺的生殖器。,雌性激素的危害,雌性激素造成的環(huán)境污染,同樣可能造成某些物種的

12、絕種。 通過食物鏈產(chǎn)生的富集作用,可引起人體的內(nèi)分泌失調(diào), 對男性的危害：使男性精子數(shù)量下降或出現(xiàn)女性化、性早熟、抑制骨骼發(fā)育等。 對女性的危害：可引起女性 性早熟、生殖器官畸形和癌變,這一效應(yīng)在其女性后代中表現(xiàn)更顯著。 對人類后代的危害：這些激素透過胎盤,可引起用藥者子宮內(nèi)膜及女性后代的陰道宮頸癌變和男性后代的精子發(fā)育不良、生殖器畸形。,對其他動物的危害,雌性激素的污染對人類之外的其他動物,同樣有著嚴(yán)重的影響。 美國出現(xiàn)的雄性美洲獅雌性化、加拿大的海豚在生殖周期出現(xiàn)卵巢異常、南極企鵝產(chǎn)下無精卵以及其他一些連體、畸形動物的較高比例出現(xiàn),可能均與環(huán)境激素污染有關(guān)。,二、樣品處理,（一）皮質(zhì)激素的

13、樣品處理 （二）同化激素的樣品處理,（一）皮質(zhì)激素,1、皮質(zhì)激素樣品預(yù)處理 液體樣品(奶、血液、尿液)提取前需要脫脂肪,通常在4 、7000g離心,除去浮在上層的脂肪。 組織樣品(肌肉、肝、腎)先要用切碎機或勻漿器進行組織破碎。水或醋酸鹽緩沖液常用于樣品的稀釋。 肝臟或尿樣中的皮質(zhì)激素結(jié)合物較多,因此先用葡糖苷酸酶/硫酸酯酶水解。 由于酶解反應(yīng)較慢,為保證水解完全,可在較高的溫度下來加速水解或延長孵育時間。 用超臨界萃取法提取時,先要將組織樣品勻漿,再進行冷凍干燥。,2、提取皮質(zhì)激素,在一定的pH值條件下,一般用有機溶劑對樣品提取和除蛋白。 例如,氯仿提取牛奶中的氫化可的松; 二氯甲烷-正己烷

14、(4+1)提取牛奶中游離的氫化可的松和21-醋酸酯; 乙酸乙酯提取動物組織中的氫化波尼松、氟強的松龍、氟羥強的松龍、倍他米松,牛奶中的甲基強的松龍，牛奶中的氫化波尼松和地塞米松; 含0.1mol/L氫氧化鈉的乙酸乙酯提取牛組織中的地塞米松;,有機溶劑法提取,甲醇提取牛肉組織中的5種皮質(zhì)激素; 乙腈提取牛肝臟中的5種人工合成的皮質(zhì)激素和牛組織中的地塞米松; 乙醚提取牛糞中9種合成的皮質(zhì)激素; 二氯甲烷提取動物脂肪中的氟強的松龍; 丙酮提取動物肝臟(腎臟和肌肉中的氟強的松龍。 此外,牛奶和尿樣可以直接用水或醋酸鹽緩沖液稀釋并提取。,3、凈化,粗提取液中含大量的內(nèi)源性干擾物質(zhì),為了消除或降低干擾并濃

15、縮分析物,樣液需要凈化處理。 凈化方法包括液-液萃取、固相萃取、免疫親和色譜及柱切換技術(shù)等。 液-液萃取可以簡單的一次溶劑萃取,也可以多次溶劑萃取。萃取次數(shù)的多少,很大程度上取決于色譜的分離效率和選擇性。 色譜的分離度和選擇性愈高,樣品的提取和凈化步驟可以簡略一些,還可以提高分析效率。,液-液萃取法,液-液萃取可以除去生物樣品中大部分雜質(zhì)和蛋白質(zhì)。 例如,氫化波尼松、氟強的松龍、氟羥強的松龍和倍他米松的乙酸乙酯提取液,依次用稀酸溶液和稀堿溶液洗滌,可以除去堿性和酸性的水溶性雜質(zhì)。 地塞米松的乙酸乙酯提取液,可以用氫氧化鈉溶液洗滌,以除去酚類雌激素。 甲基強的松龍的初提液蒸發(fā)至干后,用乙腈溶解,

16、加入正已烷提取,正已烷提取液再用飽和的硫酸鈉水溶液提取,最后用二氯甲烷提取。,氟強的松龍?zhí)崛∫赫舭l(fā)至干后,依次用乙腈和正己烷,正己烷和水進行液-液萃取,最后用二氯甲烷提取。 通過液-液萃取對分析物的提純,可以降低儀器檢測的背景干擾,大大提高分析方法的檢測靈敏度。 皮質(zhì)激素的初提液還可通過三相液-液分配凈化： 當(dāng)組織樣用乙腈水溶液初提后,上清液加入正己烷和二氯甲烷,進行乙腈、正己烷和二氯甲烷的三相液-液萃取,非極性組分被分配到正己烷相中,極性和離子化組分被分配到底層水相中,皮質(zhì)激素和其他中等極性組分則分配到中間乙腈相中。,固相萃取法,采用有機溶劑萃取法容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,因而常常導(dǎo)致提取回收率偏低

17、或不穩(wěn)定。 固相萃取法克服了這一缺點,且具有操作簡便、快速的優(yōu)點。 常用的固相萃取柱吸附劑有C18、C8和弗洛里硅藻土(Florisil)等。 例如,C18固相萃取柱用于豬血漿中天然的和合成的皮質(zhì)激素凈化,血漿或血清樣品中氫化可的松凈化。 Florisil柱用于牛奶中氫化可的松凈化和牛組織中氟強的松龍凈化。,免疫親和柱色譜法,免疫親和柱具有高的專一性,近年來發(fā)展迅速,已應(yīng)用于皮質(zhì)激素的生物樣品制備。 例如,用兩種抗體結(jié)合的免疫親和柱,可以分離純化肝、牛奶、尿樣和糞樣中9種皮質(zhì)激素。 免疫親和色譜與GC-負離子化學(xué)電離質(zhì)譜聯(lián)用,已用于馬組織中雙氟美松的確證分析。,柱切換技術(shù),柱切換技術(shù)自動化程度

18、高,在線濃縮和純化,大大簡化了樣品的前處理步驟。 例如,牛組織中地塞米松測定時,樣液經(jīng)苯基柱初級分離后流至硅膠預(yù)富集柱中,通過柱切換,改變流動相將富集柱中的待測物洗脫至氰丙基分析柱中分離。,超臨界CO2流體萃取法,超臨界CO2流體萃取法具有低溫、快速、無溶劑萃取的優(yōu)點。 例如,超臨界流體萃取法與HPLC聯(lián)用,用于牛組織中地塞米松殘留的測定。,（二）同化激素的樣品處理,1、樣品預(yù)處理： 液體樣品(尿、血漿、膽汁、牛奶)在提取前,可用水或磷酸鹽緩沖液稀釋。 半固體樣品(肌肉、肝、腎)在提取前需要均質(zhì)。 脂肪樣可在4060 下加熱,使脂肪融化成液體。,2、提取,生物樣品中游離的類固醇激素可以用丙酮、

19、乙醚、乙腈、堿性乙腈、四氫呋喃、叔丁基甲醚和氯仿-甲醇等有機溶劑提取。 激素結(jié)合物的水溶性較大,不易被有機溶劑提取,可先將樣品水解后再提取游離激素。 常用的水解方法有酶水解和堿水解兩種。 酶水解通常使用葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶,前者可專一地水解葡糖苷酸結(jié)合物,后者可水解硫酸酯結(jié)合物。,由于尿樣和組織中通常同時存在上述兩種結(jié)合物,常使用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.57.0,于37 溫育過夜。 堿水解通常使用氫氧化鈉溶液,由于合成類固醇常以酯制劑注入動物,水解后使酯類釋放出游離的類固醇。,3、凈化,粗提取液的凈化方法包括液-液萃取、固相萃取法、液相色譜、免疫親和色譜和超臨界流體色譜等

20、。 為了達到更好的純化效果,可將幾種方法結(jié)合應(yīng)用。,液-液萃取法,液-液萃取大多是去除水溶性提取液中的脂肪, 例如,乙腈或甲醇提取液中加入正己烷或異辛烷,可脫去脂類物質(zhì)。 脂肪樣中的激素(30種雄激素)可用正己烷提取,再用甲醇-醋酸鹽緩沖液(pH5.2)提取正己烷中的激素,同時去除脂類物質(zhì),水性提取液再用二氯甲烷抽提。 當(dāng)乙腈粗提取液調(diào)節(jié)pH至13時,加入正己烷和二氯甲烷進行三相液-液萃取,極性和離子型酸性物質(zhì)進入水相,脂類等低極性物質(zhì)則進入上層正己烷相中,而中等極性物質(zhì)(如待測物：群勃龍和表群勃龍、去甲睪酮和美侖孕酮)進入中間乙腈相中。,固相萃取法,柱層析采用氧化鋁、硅膠和Celite吸附劑

21、,可有效分離分析物和內(nèi)源性雜質(zhì),已應(yīng)用于肉樣中七種類固醇的純化。 固相萃取法具有簡便、快速、經(jīng)濟等優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于激素類藥物的凈化。 正相柱常用硅膠、氧化鋁、氰基型和氨基型吸附劑,反相柱常用C18和C8吸附劑。 C18固相萃取柱和Amberlite XAD-2離子交換柱適合純化親脂性或中性的同化激素。,司坦唑醇在C18固相萃取柱上的回收率偏低,是由于它的結(jié)構(gòu)為吡唑環(huán)和雄(甾)烷環(huán)縮合而成,兩個活潑氫可解離,具有離子化的性質(zhì),可與固定相或玻璃的活性點發(fā)生吸附,但其在C8和苯磺酸型的混合固定相小柱中,凈化效果和回收率均佳。 C18和硅膠的混合柱同樣被用來對粗提取液的純化。 C8、硅膠和氨基型的混

22、合固定相小柱被成功地應(yīng)用于肉中同化激素和異化激素的分離,激素按照極性、非極性和酚類性質(zhì)分段流出,然后再分別純化。,固相萃取柱的凈化效果有時并不能滿足質(zhì)譜檢測的要求,因此有人將固相萃取法與色譜法相結(jié)合,對樣品提取液作更高的純化。 另外,還有采用C18柱對樣液色譜分離,用自動餾分收集器收集分析物的餾分,餾分收集后吹干,然后衍生化GC分析。,柱切換技術(shù),柱切換技術(shù)也被應(yīng)用于激素的生物樣品制備。 例如,將牛肝提取液注入凝膠柱中,含同化激素的兩段餾分被切入到硅膠柱(富集柱)中,群勃龍和去甲睪酮激素在富集柱中被濃縮純化,洗脫后流入氰基柱中,再通過柱切換,流入硅膠分析柱中分離測定。,醋酸美侖孕酮為中性、脂溶

23、性的類固醇,固相萃取法對牛組織提取液中醋酸美侖孕酮的提取純化效果欠佳,故采用柱切換。 其過程為粗提取液注入苯基柱中作初級分離,含分析物的餾分被切換到硅膠預(yù)富集柱中,濃縮提純后再通過柱切換洗脫至硅膠分析柱中分離測定;若收集餾分,可用于GC-MS分析。,免疫親和柱色譜法,免疫親和柱具有專一性高的優(yōu)點,但適合同化激素純化的免疫親和柱目前還不多。 對于多殘留分析,可將幾種免疫親和固定相配伍使用。 免疫親和柱已應(yīng)用于生物樣品中己烯雄酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的純化,以及肉和尿中去甲睪酮、睪酮和群勃龍的純化。 此外,亦有報道采用在線免疫親和色譜法,對生物樣品中的去甲睪酮及其表代謝物進行純化。,超臨界流體色譜法

24、,超臨界流體萃取可以在低溫條件下獲得無溶劑的提取物,且快速,但從生物樣品中分離激素的研究目前還很少。 有報道采用超臨界流體萃取和超臨界流體色譜相結(jié)合,用來檢測豬腎中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚殘留。 超臨界CO2提取時,同化激素被柱子保留,而非極性的內(nèi)源性物質(zhì)不被保留,然后換流動相來洗脫激素,串聯(lián)質(zhì)譜檢測。,用超臨界CO2提取牛組織中7種促生長激素,發(fā)現(xiàn)極性藥物(地塞米松、曲安奈德、玉米赤霉醇)的回收率偏低,約44%58%,非極性藥物(醋酸美侖孕酮、甲羥孕酮、己烯雌酚)的回收率相當(dāng)高,約83%91%。 由于共萃取物的干擾,群勃龍不能被檢測到,尤其是脂肪和肝臟樣品中的共萃取物,對群勃龍的色譜峰

25、有嚴(yán)重干擾。因此,超臨界流體萃取法并不能取代所有的樣品處理方法。 在超臨界流體萃取前后,還需要其他凈化方法加以處理。,三、分析方法,（一）皮質(zhì)激素分析方法 有關(guān)動物性食品中皮質(zhì)激素類的殘留分析,文獻報道很少。 皮質(zhì)激素類的殘留分析主要采用色譜法,包括薄層色譜法、液相色譜法和氣相色譜法。,1、薄層色譜法,薄層色譜法具有設(shè)備簡單、經(jīng)濟等優(yōu)點,適合生物樣品的篩選分析。 早期采用苯肼硫酸溶液作顯色劑,后來采用其他一些顯色劑,如磷酸甲醇溶液、四唑藍、對甲苯磺酸和2,3,5-三苯基-2H-四唑氯。 Vanoosthyze等建立了一種高效薄層色譜法,能夠檢測注射部位中的29種皮質(zhì)激素。 樣液滴注于Kiese

26、lgel 60板上,以氯仿-甲醇作展開劑,展開后組分得到很好地分離,用2,4-二羥苯甲醛噴霧顯色,色澤差異明顯,366nm處熒光檢測分析物。,2、氣相色譜法,GC法分析動物源性食品中皮質(zhì)激素,早期采用TMS衍生化,OV-17 275cm柱分離,電子捕獲檢測器檢測。 例如,氫化波尼松、氟強的松龍、氟羥強的松龍和倍他米松TMS衍生化,采用N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺、三甲基甲硅烷咪唑和三甲基氯硅烷混合衍生劑進行硅烷化。 目前,GC-MS得到了廣泛應(yīng)用。測定地塞米松時,用TMS-enol-TMS衍生化較好。,例子：,Delahat等報道了一種GC-MS法分析肝臟、牛奶、尿樣和糞樣中的5種皮質(zhì)激

27、素(氫化波尼松、甲基強的松龍、地塞米松,雙氟美松和異氟烷)。 不同樣品的提取 肝臟樣品：取5g肝樣加10mL醋酸鹽緩沖液均質(zhì),加入Helix pomatia混合酶,于60 孵育2h,水解結(jié)束后,用20mL乙腈提取,離心,取出上清液并加入8mL正己烷和2mL二氯甲烷混合,離心,取出中間乙腈相層并蒸發(fā)至干,殘余物用1mL乙醇溶解,過C18固相萃取柱。,不同樣品的提取,牛奶樣品：取10mL牛奶,于4 離心,除去浮在上面的脂肪并將剩下的脫脂奶用等量的水稀釋,過C18固相萃取柱。 尿樣：取5mL尿樣,加入2mL pH4.8醋酸鹽緩沖液和Helix pomatia混合酶,于37孵育過夜,水解結(jié)束后,加入5

28、mL磷酸緩沖鹽,過C18固相萃取柱。 糞樣：取5g糞樣,加入10mL醋酸鹽緩沖液和35mL乙醚,振搖,離心后取出乙醚相并蒸發(fā)至干,殘余物用3mL乙醇溶解,加入12mL水和5mL正己烷,振搖,靜止分層后取出水相,過C18固相萃取柱。,不同提取樣品的凈化,牛奶、尿和糞便樣液過C18固相萃取柱后,依次用5mL水、5mL丙酮-水(20+80)、5mL甲醇-水(20+80)、5mL二氯甲烷-正己烷(20+80)和5mL乙酸乙酯-正己烷(10+90)淋洗,用3mL乙酸乙酯洗脫皮質(zhì)激素,洗脫液蒸發(fā)至干后,用0.5mL乙醇和5ml磷酸緩沖鹽溶液溶解殘余物,過免疫親和柱凈化。,肝臟樣液過C18固相萃取柱后,依次

29、用5mL水、5mL丙酮-水(20+80)、5mL甲醇-水(20 +80)和5mL正已烷淋洗,用1mL乙酸乙酯洗脫。經(jīng)過固相萃取柱凈化后,將洗脫液的pH值調(diào)至77.5,再過免疫親和柱(含地塞米松和氫化波尼松抗體的凝膠)純化,用水淋洗柱子,3mL甲醇-水(80+20)洗脫。取部分洗脫液,加入氯鉻酸吡啶氧化,氧化的皮質(zhì)激素衍生物進行GC-MS分析。 Courtheyn等對氯鉻酸吡啶氧化法作了改進,簡化了樣品前處理步驟,采用負離子化學(xué)電離GC-MS法測定尿液和糞便中地塞米松含量,以二氟美松作內(nèi)標(biāo),測定結(jié)果與酶聯(lián)免疫法一致,該方法檢測限0.1g/L。,3、液相色譜法,反相液相色譜（RP-HPLC ）和正

30、相液相色譜（ NP-HPLC ）均可用于皮質(zhì)激素的分析。 由于皮質(zhì)激素有較強的紫外吸收,因此紫外檢測法常被廣泛采用,檢測波長一般設(shè)在254nm。 但對于動物源食品中殘留的某些皮質(zhì)激素及其代謝物,則必須制備成衍生物后,進行熒光檢測。 HPLC-MS技術(shù)在皮質(zhì)激素分析中也有應(yīng)用,例如,LC-APCI-MS對牛組織中地塞米松的鑒別測定。,Goto等報道了NP-HPLC法同時分離測定血清中的地塞米松和氫化可的松。這種方法包括用9-蒽腈進行柱前熒光衍生化,衍生物經(jīng)固相萃取柱凈化,以除去過量的衍生劑及內(nèi)源性的類固醇雜質(zhì),色譜分離后用熒光檢測。 Prasad等采用NP-HPLC法同時測定血漿中氫化可的松、可

31、的松、地塞米松、強的松、氫化波尼松和甲基強的松龍殘留,最低檢測限為10g/L。 Santos-Montes采用RP-HPLC測定尿中的皮質(zhì)醇和可的松。 Schild采用RP-HPLC測定血漿中的地塞米松。,Fluri等研究了電噴霧電離LC-MS測定人尿中9種糖皮質(zhì)激素的方法。 崔曉亮等采用超高效液相色譜-串聯(lián)電噴霧四極桿質(zhì)譜法同時測走牛奶中12種糖皮質(zhì)激素的殘留。 Van de Hauwe等報道了電噴霧電離LC-MS/MS法測定牛組織中地塞米松和二氟美松殘留量。 Sangiorgi等采用大氣壓化學(xué)電離LC-MS/MS測定牛尿中7種糖皮質(zhì)激素。 Van de Hauwe等報道了采用電噴霧電離LC

32、-MS/MS分析牛肝中11種糖皮質(zhì)激素。,（二）同化激素分析方法,生物樣品中同化激素類的分析主要采用色譜法,包括薄層色譜法、氣相色譜法和液相色譜法。,1、薄層色譜法,薄層色譜法具有快速、經(jīng)濟等優(yōu)點,適合殘留分析的初篩。 例如,用于雌激素的多殘留篩選。 為了提高薄層色譜分析的靈敏度和選擇性,在顯色劑研究上做了大量的工作,一些與雌酮、雌二醇、己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉烯醇發(fā)生顯色反應(yīng)的染料被相繼報道。 重氮基染料與雌激素反應(yīng),形成重氮基衍生物、酚基和二羥基苯甲酸內(nèi)酯類的雌激素衍生物,它們的色澤強度各不相同。 此外,科林斯紅和快藍BB與激素反應(yīng)成鹽后,具有很強的色澤。,2、氣相色譜法,在20世紀(jì)

33、70年代GC-MS已被用于同化激素的分析。 20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的毛細管GC使GC-MS結(jié)構(gòu)簡化、儀器成本下降。毛細管GC和SIM檢測方式使GC-MS發(fā)展成為一種成熟的、集高效分離、高靈敏度檢測和結(jié)構(gòu)鑒定為一體的分析技術(shù)。 目前,GC-MS已成為同化激素殘留分析中普遍采用的方法。,SIM檢測： 選擇離子監(jiān)測技術(shù),同化激素及其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中含有多個羥基或酮基等極性基團,為高極性、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定差的化合物,GC法難以直接分析,因此需衍生化使形成易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的衍生物,以提高其色譜性能。 由于它們的結(jié)構(gòu)中含羥基和酮基,常用的衍生方法包括硅烷化、?；碗炕?例子：,1992年,Daeselei

34、re等報道了GC-MS法測定牛肉和牛尿中多種同化激素(去甲睪酮、睪酮、雌二醇、炔雌醇、孕酮、群勃龍、玉米赤霉醇、己烯雌酚、去氫睪酮、美雄酮、甲睪酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羥孕酮、氯睪酮、醋酸氯睪酮)的殘留。 樣品用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶水解,經(jīng)液-液萃取和固相萃取柱凈化,再通過HPLC純化,分別收集含分析物的五段餾分,衍生后GC-MS檢測。,1997年,Hartmann等報道了GC-MS法測定牛肉組織中類固醇激素,包括雄烯二酮、雄酮、睪酮 、孕酮、雌酮、雌二醇、脫氫表雄酮、二氫睪酮、表睪酮、羥孕酮、孕烯醇酮、雌三醇、甲基睪酮和甲羥孕酮。 2003年,Dickson等采用GC-MS法篩選和確證牛尿中己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚