1、,上海島津分析中心 姚 勁 挺 Tel:64728442*321 Fax:上海代表處免費電話：800-810-0439 維修部零配件,液相色譜,HPLC的環(huán)境設置：,HPLC的日常操作條件：溫度：1030；相對濕度80； 最好是恒溫、恒濕，遠離高電磁干擾、高振動設備，有良好的通風設施。,一、色譜起源,液相色譜流程圖,輸液泵,進樣器,色譜柱,柱溫箱,檢測器,溶劑,數(shù)據(jù)處理,HPLC的分離類型,正相色譜 (NP-HPLC) 反相色譜 (RP-HPLC) 反相離

2、子對色譜 (RPIC) 離子交換色譜 (IEC) 空間排阻色譜 (SEC) 手性化合物分離模式 (Chiral separation mode),液相色譜按兩相極性不同分為: 正相色譜 反相色譜 化合物保留時間隨流動相配比的變化 不同極性的化合物出峰順序,正相HPLC 色譜柱,硅膠型 氰基型 氨基型 糖類分析 二醇基型 蛋白質(zhì)分析,Silica gel,Si,Si,-Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH),Modified Si,反相HPLC 色譜柱,C18 (ODS) type C8 (octyl) type

3、C4 (butyl) type Phenyl type TMS type Cyano type,-Si-C18H37,Si,Non-polar property,流動相,流動相選擇注意事項： 純度：采用“ HPLC ”級溶劑 避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑 對試樣有適宜的溶解度 溶劑粘度要小 與檢測器相匹配 流動相配制時的順序,溶 劑 等 級,水的等級 純化水 蒸餾水 去離子水,波長 (nm),純化水,去離子水,因為不純物的存在，去離子的吸光率較高,純化水中去除了無機和有機的污染物,吸光率,HPLC用水可以通過以下幾個方面來得到：,1 專門的純水機或超純水機； 2 去離子水重蒸；

4、3 二次或三次重蒸水； 4 采用類似家用的純水機； 5 市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水； 6 其它途徑；,不管采用何種途徑，配制流動相應用新鮮水，水質(zhì)越高放置時間越短。 理想的HPLC用水應為18.2的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。,溶劑前處理,過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。,30mm內(nèi)徑： 適用于大進樣量的過濾，由0.22m和0.45m兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。 13mm內(nèi)徑： 適用于范圍廣的過濾，由0.22m和0.45m兩種規(guī)格,材料

5、為纖維素。 3mm內(nèi)徑： 適用于小進樣量的過濾，由0.22m和0.45m兩種規(guī)格。處理樣品體積為7l。,樣品過濾頭的類型：,濾膜類型：,聚四氟乙烯濾膜： 適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。 醋酸纖維濾膜： 不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關樣品。 尼龍66濾膜： 適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可用于強酸,70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。 再生纖維素濾膜： 具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機溶劑。,溶劑前處理,脫氣 目的：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 一般混合溶劑中能容納的空氣量往往要比單個溶劑所能容納的空氣總量要小 氣泡對測定的影響：

6、 1）柱壓波動，流量偏小 2）基線波動,返回,柱塞往復泵,島津VP系列輸液泵,目的 單元 流速范圍特性和應用,分析 LC-10ADVP0.001-9.999無脈動，適于半微量LC 和 LC-MS,LC-10ATVP0.001-9.999非凡的耐用性， 適于常量分析,*所有單元都既可做高壓梯度又可做低壓梯度,等度洗脫,梯度洗脫,分析時間長,分離度差,MeOH / H2O = 6 / 4,MeOH / H2O = 8 / 2,( column : ODS type ),等度洗脫,95%,30%,MeOH 濃度,梯度洗脫,混合器,低壓梯度比例閥,高壓梯度,低壓梯度,脫氣機,高壓/低壓梯度系統(tǒng),返回,

7、高壓梯度系統(tǒng) 梯度準確度好 系統(tǒng)復雜 (需兩臺或三臺泵) 低壓梯度系統(tǒng) 系統(tǒng)簡單 需在線脫氣機 存在時間滯后效應,高壓/低壓梯度系統(tǒng),進樣器,自動進樣器 手動進樣器 原理：（六通閥） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入,返回,HPLC六通閥進樣器的使用及保養(yǎng),六通閥進樣器是高效液相色譜系統(tǒng)中最理想的進樣器，它是由圓形密封墊(轉子)和固定底座(定子)組成。美國Rheodyne公司的六通閥進樣器最為通用，各大HPLC儀器制造商均以此產(chǎn)品作為儀器的進樣器。,工作原理,手柄位進樣(Load)位置時，樣品經(jīng)微量進樣針從進樣孔注射進定量環(huán)，定量環(huán)充滿后，多余樣品從放空孔排出； 將手柄轉動至進樣(Inj

8、ect)位置時，閥與液相流路接通，由泵輸送的流動相沖洗定量環(huán)，推動樣品進入液相分析柱進行分析。,手動進樣器的原理圖,裝填狀態(tài),進樣狀態(tài),返回,雖然六通閥進樣器具有結構簡單、使用方便、壽命長、日常無需維修等特點，但正確的使用和維護將能增加使用壽命，保護周邊設備，同時增加分析準確度。如使用得當?shù)脑?，六通閥進樣器一般可連續(xù)進樣3萬次而無需維修。,手柄處于Load和Inject之間時，由于暫時堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉到進樣位，過高的壓力在柱頭上引起損壞，所以應盡快轉動閥，不能停留在中途。在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側緊貼進樣器密封管內(nèi)側，密封性能

9、好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。,六通閥進樣器的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。使用部分裝液法進樣時，進樣量最多為定量環(huán)體積的75，如20l的定量環(huán)最多進樣15l的樣品，并且要求每次進樣體積準確、相同；使用完全裝液法進樣時，進樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20l的定量環(huán)最少進樣60至100l的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達到所要求的精密度及重現(xiàn)性。推薦采用100ul的平頭進樣針配合20ul滿環(huán)進樣。,可根據(jù)進樣體積的需要自已制作定量環(huán)，一般不要求精確計算定量環(huán)的體積，譬如，一根名義上10l的定量環(huán)，實際是9l還是1ll并不重要，因為

10、被測樣品和校正樣品的進樣體積保持一致，在計算結果時誤差都被抵消了。,進樣樣品要求無微粒和能阻死針頭及進樣閥的物質(zhì)，樣品溶液均要用045m的濾膜過濾。防止微粒阻塞進樣閥和減少對進樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進樣系統(tǒng)中，每次結束后應沖洗進樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，在進樣閥的Load和Inject位置反復沖洗，再用無纖維紙擦凈注射器針頭的外側。,進樣體積,檢測器響應值,定量管體積的一半,3倍定量管體積,全量注入,部分注入,進樣體積與響應值關系,返回,泵的保養(yǎng),使用流動相盡量要清潔； 進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗； 流動相交換時要防止沉淀； 避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡

11、； 每次分析結束后，要反復沖洗進樣口，防止樣品的交叉污染；,色譜柱,1）柱壓低于150kgf/cm2（15cm色譜柱） 2）柱溫在40左右，最高使用溫度為50 3）流動相PH使用范圍為27.5,返回,ODS柱的使用注意點：,柱的保養(yǎng)：,柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動； 當柱子和色譜儀聯(lián)結時，閥件或管路一定要清洗干凈； 要注意流動相的脫氣； 避免使用高粘度的溶劑作為流動相； 進樣樣品要提純； 嚴格控制進樣量； 每天分析工作結束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品； 每天分析測定結束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗?若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封閉；,流動相注意點,離子對試劑的使用

12、具有緩沖鹽流動相的使用 分析結束及開始 流動相平衡 加快平衡時間 異丙醇的使用,LC檢測器,紫外可見檢測器（UV/VIS） 二極管陣列檢測器（PDA） 示差檢測器（RID） 電導檢測器（CDD） 熒光檢測器（RF） 電化學檢測器（L-ECD） 質(zhì)譜檢測器（MS） 蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）,反相色譜分析時 添加10-30 mM 三乙胺(triethylamine) 可以抑制堿性化合物色譜峰拖尾 添加1% 醋酸acetic acid 可以抑制酸性化合物拖尾 三乙胺(triethylamine) 也用于正相色譜中,使硅膠部分去活性, 以獲得化合物合適的保留時間,維護流程圖,管線選擇,材料 不銹鋼

13、 Teflon PEEK (聚醚醚酮) 尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.,管線材料,不銹鋼 (可用于所有連接) 能承受幾千 kg/cm2 壓力 酸性或高濃度鹽環(huán)境中易腐蝕 (尤其在pH小于2時) PEEK (可用于所有連接) 能承受高達 250 kg/cm2壓力 可在整個PH范圍(pH 1-14)內(nèi)使用 不適用于高溶解性溶劑如氯仿等 Teflon (用于柱后阻尼管、反應管和排液管) 化學惰性大 能承受 5 kgf/cm2 壓力,接頭

14、,不銹鋼接頭 / 墊圈 主要用于輸液泵、進樣器的連接 能承受 400 kgf/cm2壓力 一旦固定，墊圈不可再動 PEEK接頭 主要用于色譜柱、檢測器的連接 易于安裝 能承受 250 kgf/cm2壓力 容易產(chǎn)生死體積,不銹鋼接頭,墊圈,PEEK接頭,吸濾頭,材料：不銹鋼燒結，孔徑10um 故障：堵塞 表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成 措施：用異丙醇（或5稀硝酸），超聲波清洗，再用蒸餾水清洗,單向閥,單向閥,單向閥結構,球座,單向閥原理,單向閥清洗,故障：寶石球或球座受污導致密封不好 表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大 措施： 打開排液閥，以異丙醇為流動相輸液 拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波清洗,故障1：寶石球

15、粘附于墊片 表現(xiàn)：泵無法吸液或排液，流路不通 措施：1）用針筒抽出口單向閥以產(chǎn)生負壓，使寶石球與墊片分開 2）拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波清洗,單向閥粘結,柱塞密封圈的更換,故障：密封圈磨損導致密封不良 現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或漏液 措施：更換密封圈 注意點： 1）更換前，新密封圈用異丙醇 浸泡15 min 2）拆卸泵頭前，柱塞桿復位 （PSET）,線路過濾器,故障：堵塞 現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓力 偏高 措施：異丙醇（或5稀硝酸）， 超聲波清洗 判斷依據(jù)：關閉排液閥，斷開出口管路，設定流速1mL/min，如壓力5kgf/cm2，則堵塞。,手動進樣器,操作注意點： 1）進樣時，進樣針應

16、插到底 2）不使用時將針頭留在進樣器內(nèi) 3）進樣應使用液相色譜專用平頭 進樣針 4）樣品溶液pH小于10, 常用密封墊的材質(zhì)適用pH10, 否則換特氟隆材質(zhì)的密封墊pH10-13 5）清洗應使用專用針口清洗器,清洗針口,色譜柱柱效降低原因,濾片或填料堵塞 樣品或流動相中雜質(zhì)吸附 機械振動產(chǎn)生空隙 填料變性,濾片或填料堵塞,使用預柱 緩沖液和溶劑使用0.45um濾膜過濾 樣品溶液使用0.45um濾膜過濾 反向連接色譜柱，使用清洗溶劑以小流量送液 打開柱頭，清洗或更換濾片,Back,樣品或流動相中雜質(zhì)吸附,雜質(zhì)會產(chǎn)生拖尾峰 使用高溶解性溶劑清洗色譜柱,僅 1 cm深度 會被污染,色譜柱,取出污染填料，裝填新的填料,機械振動產(chǎn)生空隙,不要撞擊色譜柱如 色譜柱掉落或柱壓急劇變化 。,填料變性,產(chǎn)生峰變形（如拖尾等）的原因,柱進口污染 柱內(nèi)存在空隙 樣品過載 溶解樣品的溶劑選擇不當 二次保留效應 擔體表面存在硅醇基 擔體表面殘留重金屬,溶解樣品的溶劑選擇不當,最好不要選擇高溶解性的試劑作為溶解樣品的溶劑,最好注入少量樣品,溶解性效應,低溶解性溶劑,高溶解性溶劑,Back,機械振動產(chǎn)生空隙,不要撞擊色譜柱如 色譜柱掉落或柱壓急劇變化 。,Back,紫外檢測器,紫外燈的保養(yǎng)：,在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成后