1、補 充 2 酶催化活性的測定方法,目 的,掌握定時法和連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性的原理及方法,一、測定酶促反應速度的兩類方法,（一）酶促反應速度的表示方法 單位時間的底物的消耗量（-dS/min） 單位時間的產(chǎn)物的生成量（dP/min）來表示,（二）測定方法分類 定時法 在一定時間內通過測定總變化量再計算出速度. 連續(xù)監(jiān)測法 直接用來測定速度,（一）定時法,1.概念 在足量的底物系統(tǒng)中，加入一定量的酶試劑，反應一定時間后，加入終止劑終止反應，然后測定底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量 2.酶活性的結果計算 假設某一樣品的酶活性為X（U/L），取樣品量Vs毫升與底物緩沖液Vr毫升孵育，經(jīng)過t分鐘反應，加入終止

2、液 Ve(ml)，檢測到產(chǎn)物凈吸光度增加為A，該產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)為 （終點法的摩爾消光系數(shù)一般可通過帶標準求得）比色皿光徑為b(cm),若把A/t以A/min表示，則此定時法測定酶活性的計算公式與連續(xù)監(jiān)測法相同,3.定時法與終點法和兩點法的區(qū)別,定時法 是經(jīng)過一定時間（固定的時間）反應后終止反應 終點法 指反應基本達到平衡，信號變化很小，但可以不需要終止反應 兩點法 監(jiān)測反應過程中的兩個點，即某一段時間內的底物或產(chǎn)物的變化,（二）連續(xù)監(jiān)測法,1.原理 連續(xù)監(jiān)測法是將酶與底物在特定條件（緩沖液、溫度等）下孵育，每隔一定時間（2-60s）連續(xù)測定酶促反應過程中某一底物或產(chǎn)物的特征信號（如NADH

3、在340nm的吸光度）的變化，從而計算出每分鐘的信號變化速率 2.酶促反應動力學曲線 一個典型的酶促反 應過程一般包括延滯 期、線性期和非線性期,1.延滯期 對單一酶促反應而言，是指酶促反應從開始到達最大反應速度所需要的間，包括酶催化位點的暴露、底物解離后與酶結合位點的結合、酶與輔酶的結合、酶的激活等等 對于酶偶聯(lián)反應而言，延滯期還包括中間產(chǎn)物堆積到一定程后，導致指示反應速度增加，直到與待測酶酶促反應速度達到平衡所需的時間。一般來說，輔助酶越多，延滯期越長 2.線性期 是指酶促反應速度保持恒定的時期，不受底物濃度的影響。此期底物雖被不斷消耗但還不足以明顯改變酶促反應的速度，即以初速度進行 3.

4、非線性期 隨著反應的進行，底物消耗越來越明顯，反應速度明顯下降而進入非線性期。酶濃度越高在選定條件下線性期就越短。其他造成進入非線性期的原因有可逆反應增強、產(chǎn)物抑制增加、酶變性失活增加、酶聚合或解離增加等等,（二）連續(xù)監(jiān)測法酶活性的結果計算,假設某一樣品的酶活性為x（U/L），取樣品量Vs與底物緩沖液Vr孵育，延滯期為t0分鐘，測定間隔時間為t1分鐘，讀數(shù)次數(shù)為n，每間隔時間吸光度變化平均值為A，該產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)為比色皿光徑為b（cm）。反應速度分別用產(chǎn)物的生成速度和樣品中酶的催化能力來表示,二、酶活性測定方法原理,（一）直接法 根據(jù)待測酶的酶促反應底物或產(chǎn)物有特征性的理化性質，然后通過特

5、殊的儀器直接檢測 1.基于NADH或NADPH的反應原理 NADH或NADPH在340nm處有特異吸收峰，而NAD+或NADP+只在260nm處有明顯的吸收峰，監(jiān)測340nm吸光度變化可以反應NADH或NADPH的變化。利用該原理可以測定以NAD（P）+或NAD（P）H為輔酶的氧化還原酶 例如LD、G-6-PD、-HBD、AD、SD、GLDH等,一些水解酶類或轉移酶類經(jīng)過酶促反應將化合物中的某一基團水解或移去，使無顏色的底物轉變?yōu)橛蓄伾漠a(chǎn)物。人們把這類底物稱為色素原底物。根據(jù)這一原理，人們有意識地合成一系列底物用來測定酶活性，即人工合成色素原底物，利用這類底物測定的酶,2基于人工合成色素原底

6、物反應原理,3.基于氧的消耗 氧化酶在催化反應時會不斷消耗氧氣，可以設計氧電極來連續(xù)監(jiān)測氧的消耗速度 4.其他 膽堿酯酶催化乙酰膽堿產(chǎn)生乙酸，造成pH下降，可以用pH差示法測定膽堿酯酶。脫羧酶在反應過程中產(chǎn)生CO2，可以用量積法測定,（二）間接法,是指酶促反應底物和產(chǎn)物之間沒有特征性的理化性質，需通過另一個化學反應或生化反應，將底物或產(chǎn)物轉化為有明顯特征理化性質的另一個化合物。用直接法來測定的酶類非常有限，很多情況下不得不使用間接法,大多數(shù)定時法都是在酶促反應終止后加入另一個試劑與底物或產(chǎn)物反應，轉化為有色化合物，再用分光光度法檢測。也有個別酶類不終止反應，加入與酶促反應無關的試劑，但能與酶促

7、反應的某一產(chǎn)物反應生成有特征性的化合物。 例如：膽堿酯酶催化?；虼憠A類底物后，生成的硫代膽堿（SCh）與5，5-二硫代-雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）反應，生成黃色陰離子5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-TNBA） 酸性磷酸酶測定，利用-萘酚磷酸鹽做底物，經(jīng)酸性磷酸酶水解后釋放萘酚，與試劑中的固紅TR發(fā)生偶氮反應，生成黃色化合物,1.化學法,在酶活性測定時，常采用另一個（指示酶）或幾個酶（輔助酶和指示酶）將測定酶的某一產(chǎn)物轉化為新的產(chǎn)物，當其他酶的反應速度與待測酶反應速度達到平衡時，可以用指示酶的反應速度來代表待測酶的活性。可以表示為： 指示酶是指能監(jiān)測反應速度的酶 輔助酶在酶偶聯(lián)反應中可以一個或多個，也可以