1、轉(zhuǎn)錄組分析,張彩華20151031,1 轉(zhuǎn)錄組的定義,轉(zhuǎn)錄組： 廣義轉(zhuǎn)錄組 是指某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞中所有轉(zhuǎn)錄和加工的RNA分子(包括 信使RNA， 核糖體RNA， 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和非編碼RNA）。 狹義轉(zhuǎn)錄組 是指可直接參與翻譯蛋白質(zhì)的mRNA總和。,2 轉(zhuǎn)錄組的研究?jī)?nèi)容和意義,轉(zhuǎn)錄組的研究主要包括三個(gè)內(nèi)容,發(fā)育調(diào)控,環(huán)境適應(yīng),免疫互作,發(fā)育調(diào)控,發(fā)育調(diào)控研究的核心內(nèi)容是形態(tài)建成；形態(tài)建成是高等動(dòng)植物外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的起源、發(fā)育和建成的過(guò)程。例如：動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程，植物種子萌發(fā)及形態(tài)建成等一直是研究的熱點(diǎn)。,環(huán)境適應(yīng),含水量變化；新陳代謝變化（分解大于合成）；激素變化（ABA/IAA/GA）光

2、合強(qiáng)度變化等；,光合作用下降；酶活性變化；破壞正常物質(zhì)代謝（蛋白質(zhì)分解，脯氨酸積累，破壞核酸代謝）；激素變化。,SOD活性下降；光合作用變化；葉綠素含量降低；蛋白質(zhì)分解；脯氨酸、甜菜堿含量變化，激素變化。,酶的變化，增加或分解（如混合功能氧化酶等），超氧化物歧化酶、蛋白質(zhì)合成或DNA修復(fù)均會(huì)受到影響。,蛋白質(zhì)變性； 膜脂液化； 有毒物質(zhì)積累等；,低溫及凍害,高溫,干旱及洪澇,鹽堿,環(huán)境污染,哺乳動(dòng)物,植物,微生物,海洋生物,昆蟲(chóng),免疫互作,自然環(huán)境中，動(dòng)植物常會(huì)經(jīng)歷各種病原物（病毒、細(xì)菌、真菌、害蟲(chóng)）侵害，嚴(yán)重危害動(dòng)植物生長(zhǎng)、發(fā)育及健康。在長(zhǎng)期演化過(guò)程中，為更好的適應(yīng)壞境，動(dòng)植物逐漸形成了多種

3、與病原物對(duì)抗的生理途徑。,轉(zhuǎn)錄組的研究意義,轉(zhuǎn)錄組的研究不僅可以解釋細(xì)胞或組織的基因組的功能元件，揭示分子成分，還可以用來(lái)認(rèn)識(shí)生物學(xué)進(jìn)程和疾病發(fā)生機(jī)制，同時(shí)，對(duì)基因及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)物功能研究的功能基因組學(xué)，將為疾病控制和新藥開(kāi)發(fā)、作物和畜禽品種的改良提供新思路，為人類解決健康問(wèn)題、食物問(wèn)題、能源問(wèn)題和環(huán)境問(wèn)題提供新方法。,3 轉(zhuǎn)錄組研究方法,三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,基于雜交技術(shù)的cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片,3 轉(zhuǎn)錄組研究方法,3 轉(zhuǎn)錄組研究方法,基于Sanger測(cè)序法的SAGE、 LongSAGE和MPSS,3 轉(zhuǎn)錄組研究方法,基于二代測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）,3 轉(zhuǎn)錄組研究方法,RNA

4、-seq的優(yōu)勢(shì),4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)的原理和流程,樣品制備（植物RNA提取的方法）,4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)的原理和流程,1. 利用RNeasy Plant Mini Kit提取總RNA 2. 利用TRIZOL試劑盒提取RNA 3. CTAB法提取植物總RNA,RNA質(zhì)檢參數(shù)OD260/OD280,OD260/OD230 A230: 測(cè)定其它碳源物質(zhì)，如酚，糖類等。 A260：核酸的吸收峰測(cè)，測(cè)RNA，DNA，引物等的濃度用的。 A280：蛋白質(zhì)的吸收峰。 RIN值：RIN=RNA integrity number，即 RNA 分子完整數(shù)，從 0-10，直接反應(yīng)了 RNA

5、質(zhì)量的好壞，此數(shù)值越大表明 RNA 質(zhì)量越好越完整。,4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)的原理和流程,RNA樣品檢測(cè),RIN=6.0,RIN=10,合格標(biāo)準(zhǔn)： 1. rRNA 比率28s/18s 1.1, RNA完整系數(shù)(RIN) 7 2. 28s和18s條帶明顯(變性瓊脂糖凝膠電泳) 3. 比率260nm/280nm 2.0 (分光光度計(jì)測(cè)量)。,4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)的原理和流程,RNA文庫(kù)構(gòu)建,文庫(kù)庫(kù)檢,4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)的原理和流程,文庫(kù)構(gòu)建完成后，分別使用Qubit2.0和Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的濃度和插入片段大?。?Insert Size）進(jìn)行檢測(cè)，使

6、用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量,上機(jī)測(cè)序,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,測(cè)序數(shù)據(jù)處理和過(guò)濾,測(cè)序數(shù)據(jù)以fq格式保存：,堿基質(zhì)量值 = (字符的)ASCII值 64/33 范圍：2-40 堿基質(zhì)量值與測(cè)序錯(cuò)誤率的對(duì)應(yīng)關(guān)系： Qphred = -10 log10(e),5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾： 1.去除含接頭的reads； 2.去除 unknown bases(堿基N) 比例高于5%的reads； 3.去除低質(zhì)量reads(一個(gè)read中質(zhì)量值 7 的堿基含量高于65%) 數(shù)據(jù)要求： 1.Q20%80%； 2.有效數(shù)據(jù)量達(dá)到要求； NewMaster：/home/sh

7、are/users/zhangcaihua2013/projects/Pop.Timeseries.Transcriptome/NaCl/02.filter_fastq_gz.pl,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,兩種組裝思路,Assembly-first (de novo) Trinity SOAPdenovo(-Trans) (Trans-)AByss Velvet Oases Mapping-first (reference-based)： Tophat Cufflinks Scripture,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）, de novo組裝流程

8、,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝原理）,對(duì)于一個(gè)給定的read: GTCGAGG read長(zhǎng)度：7bps 取kmer長(zhǎng)度為4bps 如下：,構(gòu)建De Brui jn 圖：,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝原理）,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,簡(jiǎn)化,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝原理）,糾錯(cuò)：Tips removed,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝原理）,糾錯(cuò)：Bubbles removed,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝原理）,解開(kāi)短的重復(fù)序列（If therere reads assigning one outgoing branch for each incom

9、ing branch）,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝原理）,構(gòu)建Scaffold： Map reads to contigs,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝原理）,Contigs are connected by paired reads to form a scaffolding graph,將reads比到 scaffolds ,根據(jù) overlap 在gap處延伸,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝原理）,Trinity,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,1. 構(gòu)建kmer庫(kù)(k = 25)； 2. 去掉潛在的測(cè)序錯(cuò)

10、誤k-mer； 3. 選取最高頻的k-mer 作為種子進(jìn)行組裝； 4. 將種子序列向兩邊延伸, 使用過(guò)的k-mer 從庫(kù)中去除掉； 5.若序列不能繼續(xù)延長(zhǎng)，則輸出該contig； 6. 重復(fù)第3-5步，直到kmer庫(kù)中的所有kmer被用完。,Inchworm,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,1. 利用contig之間的overlap關(guān)系，將具有k-1個(gè) overlap關(guān)系的contig作為一個(gè)cluster； 2. 對(duì)每一個(gè)cluster，以k 1作為節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建一個(gè)De Bruijn graph； 3. 通過(guò)比對(duì)，將reads分配給contig(該reads至少必 須有k-1個(gè)堿基與

11、contig有overlap)。,Chrysalis,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,1. 對(duì)De Bruijn graph圖進(jìn)行簡(jiǎn)化，將連續(xù)的節(jié)點(diǎn)合并。 2. 利用reads的支持關(guān)系，去掉不可信的邊，最后輸出轉(zhuǎn)錄本序列。,Butterfly, 聚類去冗余步驟,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,1.所有scaffolds用mgblast進(jìn)行相似性比對(duì) 2.以scaffold作為節(jié)點(diǎn)，以scaffold之間的相似性作為邊連接形成 一個(gè)圖，每一個(gè)連通的子圖作為一個(gè)類（cluster）。 3.對(duì)每一個(gè)cluster，用CAP3組裝軟件分別進(jìn)行組裝，得到 consensus序列（構(gòu)

12、建UniGene）。, 聚類去冗余工具,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,TGICL CAP3（或phrap） Cd-hit,NewMaster：/home/users/luowenchun2010/Project/LuSongShaxi/03.cap3/CAP3,1.Contig長(zhǎng)度分布、Scaffold長(zhǎng)度分布、Unigene長(zhǎng)度分布； 2.N50：將序列按照長(zhǎng)度遞減累加，當(dāng)累加之和剛好大于 總長(zhǎng)度的一半時(shí)，最后被累加的那條序列長(zhǎng)度， 即為N50； 3.組裝準(zhǔn)確性（注釋，近緣物種之間相似性分析）。, 組裝評(píng)估,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）, 預(yù)測(cè)CDS,5 轉(zhuǎn)錄組分析方

13、法（de novo組裝）,使用transdecoder從trinity的轉(zhuǎn)錄本中提取coding region，得到對(duì)應(yīng) 的protein序列 ，利于下一步的功能注釋。,OldMaster：/home/share/software/trinity/trinityrnaseq_r20131110/trinityplugins/TransDecoder_r20131110/TransDecoder,按優(yōu)先級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)順序?qū)nigene序列與以上 蛋白庫(kù)做blastx比對(duì)，如果某個(gè)Unigene序列比對(duì)上高優(yōu)先級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白，則不進(jìn)入下一輪比對(duì)，否則自動(dòng)跟下一個(gè)庫(kù)做比對(duì)，如此循環(huán)直到跟所有蛋白庫(kù)比對(duì)

14、完。我們?nèi)last比對(duì)結(jié)果中rank最高的蛋白確定該Unigene的編碼區(qū)序列，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)密碼子表將編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列，從而得到該Unigene編碼區(qū)的核酸序列和氨基酸序列。,比對(duì)不上的Unigene用軟件ESTScan預(yù)測(cè)其編碼區(qū)。,NR KEGG SWISS-PROT COG GO, 功能注釋,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,GO（gene ontology） 基因本體，是對(duì)基因或者蛋白質(zhì)進(jìn)行注解和分類的系統(tǒng)。 三個(gè)本體（Ontology）： 分子功能(Molecular function),元件的活性。例如：結(jié)合活性、 催化活性 生物過(guò)程(Biological pr

15、ocess ),某些代謝過(guò)程從開(kāi)始到終止的過(guò) 程。例如：嘧啶代謝、 配糖基的運(yùn)輸 細(xì)胞組分(Cellular component),基因產(chǎn)物的位置。例如： 細(xì)胞核、線粒體基質(zhì)。, GO數(shù)據(jù)庫(kù),5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,功能注釋,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,1.去掉較短的組裝序列(如要求：L 200)； 2.對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類（近緣種）； 3.blastx比對(duì)，得到同源蛋白序列，對(duì)unigene進(jìn)行功能注釋。,表達(dá)量的計(jì)算,RPKM ：Reads Per Kilobase per Million reads FPKM ：Fragments/Reads Per Ki

16、lobase of exon per Million fragments mapped,Xt ：map至該基因的外顯子上的片斷數(shù) M ：所有map至基因組的測(cè)序reads的堿基數(shù)Lt：該基因外顯子堿基全長(zhǎng),Nat Biotechnol. 2010,28(5):511 Bioinformatics 2009, 25(8):1026 Geno Biol. 2010, 11:R106,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,= 10 6 Xt / 10 3, 表達(dá)量的計(jì)算,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,Final.assembly.fa.1.bt2 Final.assembly.fa.

17、2.bt2 Final.assembly.fa.3.bt2 Final.assembly.fa.4.bt2 Final.assembly.fa.rev.1.bt2 Final.assembly.fa.rev.2.bt2,NewMaster： /home/share/users/zhangcaihua2013/projects/Pop.Timeseries.Transcriptome/NaCl/01.Bowtie2/4.RPKM.pl, 表達(dá)量,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）, 差異表達(dá)基因（DEGs）,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（de novo組裝）,NewMaster： /home/sha

18、re/users/zhangcaihua2013/projects/Pop.Timeseries.Transcriptome/NaCl/03.edgeR/2.run_edgeR.pl.sh,FDR= 2,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（Reference-based 組裝）,Tophat and Cufflinks,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（Reference-based 組裝）,Tophat and Cufflinks pipeline,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（Reference-based 組裝）,轉(zhuǎn)錄組重構(gòu),Bowtie 第一步建庫(kù)：/opt/blc/genome/biosoft/bowtie-0.12.8/

19、bowtie-build *.fa *.ebwt 第二部比對(duì)：/opt/blc/genome/biosoft/bowtie-0.12.8/bowtie,Tophat /programs/tophat -o TophatOutputPE/ -p 8 /programs/indexes/hg19 Experiment1.r1.fastq Experiment1.r2.fastq,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（Reference-based 組裝）,表達(dá)量的計(jì)算,cufflinks cufflinks -p 8 -G transcript.gtf -library-type fr-unstranded -o

20、cufflinks_output tophat_out/accepted_hits.bam,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法（Reference-based 組裝）,差異表達(dá)基因的篩選,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,同源基因鑒定（Orthologs）,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,幾種簡(jiǎn)單的聚類方法,簡(jiǎn)單聚類 層次式聚類 K-means聚類 SOM自組織映射神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),熱圖,K-means聚類,SOM 自組織映射聚類,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,K-means聚類,1 導(dǎo)入已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù),3 計(jì)算FOM值,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,K-means聚類,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,K-means聚類,6 聚類參數(shù)設(shè)置,7 聚類結(jié)果,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,K-means聚類,8 圖片結(jié)果保存, GO,5 轉(zhuǎn)錄組分析方法,Blas