1、loading,12%,16%,18%,21%,26%,42%,52%,52%,63%,78%,96%,100%,1,DNA指紋圖譜技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用,2,以DNA指紋圖譜技術(shù)為基 礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,主要內(nèi)容,一、核糖體RNA基因的介紹,目前在微生物分類學(xué)及菌種鑒定研究中最有用和最常用的分子是rRNA，rRNA約占細(xì)胞中RNA總量的75%80%。 真核生物：5S、5.8S、18S、28S四種rRNA基因 原核生物： 5S、16S、23S三種rRNA基因 其中16S、18S rRNA基因大小適中，不但含有高度保守的基因片段，而且在不同的菌株間也含有變異的核酸片段，因此其應(yīng)

2、用最為普遍。,一、核糖體RNA基因的介紹,分析時(shí)可利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，將16S rDNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)生長(zhǎng)度相同但序列有異的DNA片段混合物，然后利用可變區(qū)序列的差異對(duì)不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分離。 由于16S rDNA及18S rDNA的序列，每年都以很快的速度補(bǔ)充到GenBank中去，這使得能夠比較方便地利用這一數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行微生物群體多樣性的研究。,利用rDNA測(cè)量細(xì)菌進(jìn)化和親緣關(guān)系,一、核糖體RNA基因的介紹,首先， 16S rDNA 普遍存在于原核生物中，參與生物蛋白質(zhì)的合成過程，并在生物進(jìn)化的漫長(zhǎng)歷程中保持不變，是生物演變的時(shí)間鐘。 其次，在 16S rDNA 分子中，既含有

3、高度保守區(qū)域，又有中度保守和高度變化的區(qū)域，適用于進(jìn)化距離不同的各類細(xì)菌親緣關(guān)系的研究。 第三， 16S rDNA 的相對(duì)分子量大小適中，約 1 540 個(gè)核苷酸，便于序列分析。,利用rDNA測(cè)量細(xì)菌進(jìn)化和親緣關(guān)系,利用rRNA 基因序列研究微生物多樣性可采用不同的策略，目前一般常用以下幾種方法：,二、以DNA指紋圖譜技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,1、變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳 2、單鏈構(gòu)象多態(tài)性 3、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 4、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 5、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性 6、擴(kuò)增rDNA限制性酶切片段分析 。 。,變性梯度凝膠電泳（DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（TGGE）,二

4、、以DNA指紋圖譜技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,原理,在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺，從正極到負(fù)極梯度遞加，或是形成溫度梯度，電泳中的DNA到達(dá)它的變性甲酰胺濃度或溫度時(shí)，雙鏈部分解開，造成泳動(dòng)速度發(fā)生變化，從而達(dá)到分離效果。,1、變性梯度凝膠電泳（DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（TGGE）,二、以DNA指紋圖譜技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,步驟,（1）樣品總DNA提??； （2）樣品16S或18SrDNA片段的PCR擴(kuò)增及純化；（3）制取變性梯度聚丙烯酰胺凝膠； （4）染色； （5）樣品的DGGE分析； （6）割膠測(cè)序。,DGGE,10,2、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）,二、以DNA指紋圖譜技術(shù)

5、為基礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,不同堿基序列的單鏈 DNA 分子構(gòu)象不同，DNA片段變性成單鏈后受到凝膠分子篩不同作用力，最終使不同DNA片段得到分離。電泳結(jié)束后可以將不同的條帶切下并測(cè)序，或采用特異性探針進(jìn)行雜交，進(jìn)而顯示該特定微生物類群的動(dòng)態(tài)變化。,3、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）,二、以DNA指紋圖譜技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,根據(jù)不同生物個(gè)體或種群之間DNA片段酶切位點(diǎn)有所差異的特點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生長(zhǎng)短、種類、數(shù)目不同的限制性片段，然后對(duì)這些特定DNA片段的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物進(jìn)行分析，根據(jù)特定的限制性酶譜圖可對(duì)群落中的微生物加以區(qū)分。,3、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（R

6、FLP）,二、以DNA指紋圖譜技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,(1)選用rDNA的恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物； (2)選擇性擴(kuò)增rDNA片斷； (3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進(jìn)行酶切； (4)瓊脂凝膠電泳分離產(chǎn)生限制性片斷； (5)用所得到的指紋圖譜進(jìn)行分析，根據(jù)片段的大小以及標(biāo)記片斷種類和數(shù)量的不同，分析群落的結(jié)構(gòu)及組成多樣性。,4、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）,二、以DNA指紋圖譜技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,此法與RFLP原理相同，只是在PCR引物的一端用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，這樣使得限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性圖譜更為簡(jiǎn)化，只需檢測(cè)被標(biāo)記的末端限制性片段，就可以分析復(fù)雜群落。,5、隨

7、機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（RAPD）,二、以DNA指紋圖譜技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,對(duì)整個(gè)基因組的DNA分子而言，某一引物可能會(huì)與單鏈DNA的許多位點(diǎn)結(jié)合，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用溴化乙錠染色，就可以直接檢驗(yàn)出被擴(kuò)增的DNA多態(tài)性。 該技術(shù)以隨機(jī)寡核苷酸作為引物，擴(kuò)增得到的多態(tài)性片段較短，更方便檢測(cè)兩個(gè)同源或異源等位基因的有無，適用于種內(nèi)和亞種更為細(xì)致的分類。,6、擴(kuò)增rDNA限制性酶切片段分析（ARDRA）,二、以DNA指紋圖譜技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,ARDRA 是用特定引物進(jìn)行 rDNA的擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析，這項(xiàng)技術(shù)可以為土壤細(xì)菌群落水平上提供可靠的基因型特征，這項(xiàng)技術(shù)常被用來了解各種樣品的群落結(jié)構(gòu)。 ARDRA方法最大的缺點(diǎn)是工作量大，目前，應(yīng)用該方法進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析，還沒有人設(shè)置重復(fù)。,二、以DNA指紋圖譜技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物多樣性研究方法,除此以外，還有重復(fù)基因外回文序列-P