1、第一代測序技術(shù),Sanger測序,1977年，桑格測定了第一個基因組序列，是噬菌體X174的，全長5375個堿基,1,Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2和3都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)，在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列,2,新一代測序介紹,三大測序平臺的前世今生,Lynx MPSS,Solexa,ABI SOLiD,454,Ion Torrent,Helicos

2、,SMRT,Illumina Solexa,Roche 454,Polony Seq,ABI Ion Torrent,Pacific Biosciences,3,Roche-454,454公司可謂新一代測序技術(shù)的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)Genome Sequencer 20 System，被Nature雜志以里程碑事件報道，開創(chuàng)了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被羅氏診斷公司以1.55億美元收購。 454測序原理,4,測序?qū)嶒灹鞒蹋?1、文庫制備：根據(jù)樣品的種類和實驗?zāi)康模瑢⒒?/p>

3、組DNA/cDNA片段化處理至400-800bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA（sstDNA）；然后和兩個44個堿基長的銜接子（adaptor）A、B進行平端連接。A、B 銜接子各自含有20個堿基的PCR 引物序列、20個堿基的測序引物序列和4個堿基的對照序列（TACG），除此之外，B銜接子的5端還標記有一個生物素基團，供后續(xù)的分離合適的測序模板使用。,5,測序?qū)嶒灹鞒蹋?2、Emulsion PCR：特定比例的單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上，使大部分磁珠磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA片斷。磁珠結(jié)合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個

4、獨特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進行獨立的擴增，而不受其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。擴增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增后仍結(jié)合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續(xù)的測序?qū)嶒灒?6,測序?qū)嶒灹鞒蹋?3、測序反應(yīng)：攜帶DNA的珠子與其他反應(yīng)物混合物，隨后放入PTP板中進行后繼的測序。 PTP孔的直徑（29um）只能容納一個珠子（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測序開始。每一個與模板鏈互補的核苷酸的添加都會產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的信號，并被CCD照相機所捕獲；,7,測序?qū)嶒灹鞒蹋?4、數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在10小時的運行當中可獲得10

5、0多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息，通過GS FLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進行分析。,8,454 Pyrosequencing,9,10,454 的特點與主要應(yīng)用,讀長較長，400600bp 通量較低，1Run 1M 序列，400600Mb 相對成本較高 主要應(yīng)用：de novo測序,11,Illumina solexa,Solexa 測序原理,12,Illumina solexa,13,Illumina Solexa 橋式PCR,diol,diol,1st cycle denaturation,14,Illumina Solexa Base Calling,T T

6、T T T T T G T ,T G C T A C G A T ,15,Solexa 的特點與主要應(yīng)用,讀長較短，100150bp 通量高，25G每天，120-150G每Run 主要應(yīng)用：RNA測序、表觀遺傳學(xué)研究,16,ABISOLiD,SOLiDSequencing by Oligo Ligation/Detection Oligo連接測序：通過連接酶連接，再對oligo上熒光基團進行檢測,SOLiD 5500 xl,17,ABI SOLiD測序前期制備,A 樣品片段化 磁珠連接,B 乳化PCR 3末端修飾,C 磁珠富集 轉(zhuǎn)到測序玻片,18,ABI SOLiD測序原理,19,ABI SO

7、LiD熒光結(jié)合和結(jié)果示例,SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 T11.0203.3.1113211010332111302330201 +SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 !36!8/8:!:!4626=(8.)43),(95,A. SOLiD Oligo熒光基團模式圖,B. SOLiD 測序結(jié)果示例（Color Space),20,21,SOLiD 的特點與主要應(yīng)用,讀長較短，50-75bp 精度高，可達Q40 通量高， 20-30G每天，1Run 可達120G 主要應(yīng)用：基因組重測序、SNP檢測等

8、,22,Ion torrent,Ion Torrent 測序原理,23,精度,Examples: 90%condence(10%errorrate)=Q10 99%condence(1%errorrate)=Q20 99.9%condence(.1%errorrate)=Q30,24,三種平臺的技術(shù)差異,25,三種平臺的效能參數(shù)差異,26,轉(zhuǎn)錄組測序測序流程,27,轉(zhuǎn)錄組主要分析內(nèi)容,28,小RNA測序,29,果蠅三種組織中MiRNA表達情況,30,MiRNA表達模式分析,31,新miRNA預(yù)測,32,miRNA編輯情況分析與統(tǒng)計,33,分析軟件介紹,質(zhì)量控制軟件 (Quality Contr

9、ol) 定位軟件 (Mapping the reads) 已知基因（差異）表達評估軟件 (Differential Expression) 新基因鑒定軟件 (New gene identification) 可視化展示軟件 (Virsulization) 基因功能注釋軟件 (GO term or KEGG pathway analysis),34,數(shù)據(jù)格式示例,Fastq 格式,Color Space 格式,35,Phred score,36,質(zhì)量控制,37,利用galaxy進行原始數(shù)據(jù)處理,/,38,Galaxy History VGN FASTQ,https:/main.g2.bx.psu