1、Wishingyou manyfuturesuccesses,補充內(nèi)容一 抗生素,一、抗生素概念：微生物在代謝過程中產(chǎn)生的，在低濃度下就能抑制它種微生物的生長和活動，甚至殺死其他種微生物的化學物質(zhì)。 補充：1、來源：也包括高等動、植物產(chǎn)生的代謝物，甚至包括化學合成或半合成的化合物。2、功能：也包括某些抗腫瘤、抗病毒、殺蟲除草等物質(zhì)。,二、拮抗作用：一類微生物抑制或殺死其它類微生物的作用稱為微生物拮抗作用。,三、抗生素的抗菌性能 1、選擇性作用 抗菌譜：一種抗生素只對一定種類的微生物有抗菌作 用，即抗菌譜。 2、選擇性毒力 抗生素對人體及動、植物組織的毒力，一般小于它對 致病菌的毒力，稱為抗生素

2、的選擇性毒力。a-鵝膏蕈堿 3、引起細菌的耐藥性 細菌在抗生素作用下，除了大批敏感菌被抑制或殺死以 外，常常會有一些菌株調(diào)整或改變代謝途徑，從敏感菌變?yōu)?不敏感菌，即產(chǎn)生細菌的耐藥性。,四、抗生素的抗菌作用機制 1、抑制核酸的合成 （1）與DNA結(jié)合，抑制DNA的復制和轉(zhuǎn)錄 放線菌素D、絲裂霉素C等。 （2）抑制轉(zhuǎn)錄起始、延伸 利福霉素、利福平等，與聚合酶-亞基結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄起始，另外利福霉素還具有阻斷RNA鏈延伸功能,2、抑制蛋白質(zhì)的合成 （1）抑制氨酰-tRNA的合成 吲哚霉素抑制色氨酰-tRNA的合成 （2）抑制蛋白質(zhì)合成的起始 氨基環(huán)醇類抗生素鏈霉素，引起密碼錯讀或抑制起始復合物的形成

3、； （3）抑制肽鏈的延長 四環(huán)素類抗生素（金霉素、土霉素）封閉A位，氯霉素與50S亞基結(jié)合，環(huán)己亞胺與60S亞基結(jié)合，抑制肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性。 （4）抑制蛋白質(zhì)合成的終止 嘌呤霉素具有-氨基，可以與正在生長的肽鏈羧基形成肽鍵，并釋放肽鏈。,3、改變細胞膜的通透性 多肽類抗生素具有表面活性劑的作用，能降低細菌細胞 膜的表面張力，從而改變了細胞膜的通透性，甚至破壞膜的 結(jié)構(gòu)。 離子載體抗生素（轉(zhuǎn)運離子抗生素）：某些抗生素如纈 氨霉素等是脂溶性物質(zhì)，它們能結(jié)合并運載特定的陽離子通 過雙脂層膜，很像膜系統(tǒng)上的離子載體，因此，稱它們?yōu)殡x 子載體抗生素。,4、干擾細胞壁的形成 青霉素干擾細胞壁的形成主要是抑

4、制粘肽合成 的最后一步，即轉(zhuǎn)肽作用。 5、作用于能量代謝系統(tǒng)或作為抗代謝物 抗霉素A、寡霉素、短桿菌肽S抑制氧化磷酸化作用,五、細菌對抗生素耐藥性的生物化學機制 1、耐藥菌產(chǎn)生導致抗生素失效的酶 2、耐藥菌改變對抗生素敏感的部位 例如：耐利福平菌株染色體突變，改變RNA聚合酶-亞基， 使復制酶不能與抗生素結(jié)合。 3、耐藥菌降低細胞透過抗生素的能力 （1）合成通透障礙物 （2）耐藥菌基因突變影響通透系統(tǒng) （3）產(chǎn)生轉(zhuǎn)運抗生素的拮抗系統(tǒng),補充內(nèi)容二 生物化學技術(shù),第一部分：蛋白質(zhì)操作技術(shù) 一、蛋白質(zhì)的透析 二、超濾 三、 AA紙層析 四、蛋白質(zhì)凝膠層析、離子交換層析、親和層析 五、蛋白質(zhì)電泳技術(shù)

5、六、蛋白質(zhì)免疫印跡實驗 七、蛋白質(zhì)的定量測定 八、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的測定,一、蛋白質(zhì)的透析 透析膜是半透膜，蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，它不能透過 透析膜，而小分子物質(zhì)（無機鹽、單糖等）可以自由通過透 析膜與周圍的緩沖溶液進行溶質(zhì)交換，進入到透析液中。,二、超濾,依賴于被分離物質(zhì)分子的大 小、形狀和性質(zhì)的區(qū)別，在一定的 壓力差下，水和小分子能通過具有 一定孔徑的特制薄膜滲透過膜，而 大分子不能透過膜，從而使大小不 同的分子達到分離的目的。超濾是 脫鹽、濃縮、生物大分子分離常用 的方法。,三、層析技術(shù) 層析（chromatography）：色譜。利用物質(zhì) 的吸附能力、溶解能力、親和力、阻滯作用等物理 性質(zhì)

6、不同對混合物進行分離分析的方法。,（一）AA紙層析（paper chromatography） 液-液相分配層析：纖維素吸附水為固定相，有機溶劑為流動相；分配系數(shù)=固定相濃度/流動相濃度；物質(zhì)在固定相和流動中分配系數(shù)不同，則發(fā)生不斷抽提從而在支持介質(zhì)濾紙上分開；分配系數(shù)小，遷移速度快，Rf大，分配系數(shù)大則相反。,（二）蛋白質(zhì)的凝膠過濾層析 凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進入其內(nèi)部，而大 分子物質(zhì)卻被排阻在外部，當一混合溶液通過凝膠過濾層析 住時，溶液中的物質(zhì)就按照不同相對分子質(zhì)量被分來了。,目前常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂 糖凝膠，其中最常用的是葡聚糖凝膠。 葡聚糖凝膠（Sep

7、hadex),它是葡萄糖通過-1,6-糖苷 鍵形成的葡聚糖長鏈，與交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷以醚鍵相互交聯(lián) 而成的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。,控制環(huán)氧氯丙烷的用量，可以合成網(wǎng)孔大小不同的葡聚 糖凝膠，即不同規(guī)格的凝膠。葡聚糖凝膠從G-10G-200有 多重類型。G后數(shù)字表示每克干膠充分溶脹后吸水的克數(shù)乘 以10，反映了網(wǎng)孔的相對大小。G后數(shù)字越小，其溶脹后的 網(wǎng)孔越小。一般G-10G-50適用于蛋白質(zhì)與小分子或無機 鹽的分離，G-75G-200適用于分子質(zhì)量大于10000Da的蛋 白質(zhì)的相互分離。,總體積V=V0+Vi+Vg V0：外水體積，存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積，相當于流動相容積

8、。 Vi：內(nèi)水容積，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的容積，固定相的容積。 Vg：凝膠本身的容積。 死時間（t0）：不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰最 大值所需要的時間。 死體積（V0）：不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰最 大值所需的流動相體積。 保留時間（t R）：組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間。 保留體積（VR）：組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需要的流動 相體積。,（三）離子交換層析 （ion-exchange chromatography,IEC） 利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被 分離的各種離子間的親和力不同，經(jīng)過交換平衡達 到分離目的的一種柱層析。,離子交換色譜的基本原理是離

9、子交換劑是在一種高分子的不溶性載體和其他天然聚合物上引入具有解離功能的離子基團陽離子基團或陰離子基團，這些基團可與溶液中帶有相同電荷的離子化合物進行置換反應(yīng)。在一定的pH環(huán)境中，不同物質(zhì)在溶液中的解離度不同，所帶的電荷存在差異, 與離子交換劑的交換能力也不同，利用電荷之間的差異將不同物質(zhì)分開。 O- A+ + B+ O B+ + A+ 介質(zhì) 離子 介質(zhì) 離子,包括陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂,（五）親和層析（affinity chromatography）:根據(jù)流動相中的生物大分子與固定相表面偶聯(lián)的特異性配基發(fā)生親和作用，選擇性吸附混合物溶液中的溶質(zhì)而進行的層析分離方法,四、蛋白質(zhì)電泳（el

10、ectrophoresis）技術(shù) 帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極 移動，稱為電泳。蛋白質(zhì)在非等電點時帶有電荷。,自由界面電泳 等電聚焦電泳 區(qū)帶電泳：紙電泳、乙酸纖維素薄膜電泳、凝膠電泳（圓盤電泳、平板電泳等）,（一）等電聚焦（isoelectric focusing,IEF）：當?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。即在外電場作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦（停留）在等于其等電點的pH梯度處，形成一個很窄的區(qū)帶。,通電,（二）區(qū)帶電泳：1、乙酸纖維素薄膜電泳,2、凝膠電泳,包括瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳 （1）聚丙烯酰胺凝膠：由單體丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N，N

11、-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化劑過硫酸銨（AP）或核黃素（VB2）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。 A、 TEMED催化AP生成硫酸自由基：S2O82- 2SO4- B、硫酸自由基的氧原子激活A(yù)cr單體并形成單體長鏈 C、 Bis將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),凝膠濃度： T（Acr和Bis總濃度）%= 100% C（交聯(lián)劑百分比）%= 100% a=Acr克數(shù) b=Bis克數(shù) m=緩沖液體積（ml）,a+b,m,b,a+b,（2）據(jù)電泳形式分為 圓盤電泳、平板電泳等 圓盤電泳：在玻璃

12、管中進行的凝膠電泳,平板電泳：在鋪有凝膠的玻板上進行的電泳,（3）電泳系統(tǒng),PAGE根據(jù)有無濃縮效應(yīng)分為兩大系統(tǒng)：連續(xù)系統(tǒng)和 不連續(xù)系統(tǒng)（具有分離膠和濃縮膠） 不連續(xù)系統(tǒng)的不連續(xù)性體現(xiàn)在： 凝膠孔徑的不連續(xù)性（濃縮膠孔徑大，分離膠孔徑?。?緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性 電位梯度的不連續(xù)性,（4）SDS-PAGE,在PAGE電泳體系中加入十二烷基硫酸鈉（SDS） SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生兩個后果：SDS帶有大量的負電荷，在其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷的差異，均帶有相同密度的負電荷，因而可以分子量差異將各種蛋白分開；

13、同時SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，使蛋白質(zhì)都成為形狀近似雪茄狀的長橢圓棒，SDS-蛋白質(zhì)復合物短軸相同，而長軸與蛋白質(zhì)的分子量成正比。,由此，蛋白質(zhì)-SDS復合物在凝膠電泳中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只與橢圓棒的長度，也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)有關(guān)。 電泳體系中巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵斷裂，使多肽組分分成單個亞單位。,（5）聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳（2-D）,利用蛋白質(zhì)的等電點和相對分子質(zhì)量的特異 性，將蛋白質(zhì)混合物在電荷和相對分子質(zhì)量兩個水 平上進行分離。 等點聚焦（Isoelectric focusing,IEF） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAG

14、E）技術(shù)。,等點聚焦,SDS-PAGE雙向電泳,電泳結(jié)果,五、蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western-blotting),Western-blotting：又稱免疫印跡分析技術(shù)，是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移并固定在化學合成膜的支持物上，然后以特異的親和反應(yīng)、免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)以及顯色系統(tǒng)分析此印跡。,免疫印跡電轉(zhuǎn)移方法,六、蛋白質(zhì)定量測定,（一）微量凱氏定氮法 消化：蛋白質(zhì)（或其它含氮有機化合物）與濃H2SO4共熱時，其中碳、氫兩種元素被氧化成CO2和H2O，而氮元素轉(zhuǎn)變成NH3，并進一步與H2SO4反應(yīng)生成(NH4)2SO4，殘留于消化液中，該過程通常稱為“消化”。,消化完畢后，加入過量濃堿（如NaOH）使消

15、化液中的(NH4)2SO4分解放出NH3，以蒸餾法借水蒸汽蒸出的NH3，用一定量、一定濃度的H3BO3溶液吸收。NH3與酸溶液中H+結(jié)合成NH4+，使溶液中的H+濃度降低，然后用標準強酸（如鹽酸）滴定，直至恢復溶液中原來的H+濃度為止。 (NH4)2SO4 + NaOH Na2SO4 + 2NH4OH NH4OH NH3 + H2O 3NH3 + H3BO3 3NH4+ + BO33 BO33 + 3H+ H3BO3,最后根據(jù)所用標準酸的量計算出樣品中的含氮量。大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量平均為16%，所以將測得的蛋白質(zhì)的含氮量乘以蛋白質(zhì)系數(shù)6.25（即每含氮1g，就表示該物質(zhì)含蛋白質(zhì)6.25g），即

16、可計算出蛋白質(zhì)的含量。,（二） Folin酚試劑反應(yīng),用于蛋白質(zhì)測定的Folin酚試劑反應(yīng)是雙縮脲方法的發(fā)展。該法所用試劑由兩部分組成：堿性銅試劑相當于雙縮脲試劑，F(xiàn)olin試劑含有磷鎢酸和磷鉬酸。 Folin酚試劑的顯色原理是：首先在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)銅絡(luò)合物，該絡(luò)合物隨之將磷鎢酸磷鉬酸還原成深藍色混合物（鉬藍和鎢藍）。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（約25500g/ml），其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可通過比色法定量測定蛋白質(zhì)含量。 Folin酚試劑反應(yīng)是由酪氨酸和色氨酸的還原性基團（酚基、吲哚基）引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸、Tris、蔗糖、硫酸銨、巰基化合物等對測

17、定均有干擾作用。,（三）考馬斯亮藍法（Bradford法）測定蛋白質(zhì)含量,考馬斯亮藍G250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍G250在酸性溶液中呈棕紅色，最大吸收峰在465nm；當它與蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合成復合物時變?yōu)樗{色，其最大吸收峰移至595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（11000g/ml），蛋白質(zhì)染料復合物在595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。,蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G250的結(jié)合十分迅速，約2min即可反應(yīng)完全，其復合物在1h內(nèi)保持穩(wěn)定。由于蛋白質(zhì)染料復合物具有很高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度（最低檢出量為1g）。由于染色法簡單

18、迅速，抗干擾性強，靈敏度高，線性關(guān)系好，近年來在某些方面有取代經(jīng)典的Lowry法的趨勢，是一種較好的蛋白質(zhì)快速微量測定方法。,七、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的測定方法,X射線衍射：通過測量一束給定波長的X射線被原子周圍的電子所衍射后在相紙上產(chǎn)生的點的位置和強度，可以確定一個晶胞中原子的空間排列。 核磁共振（NMR）：由原子核的量子特征-核自旋角動量產(chǎn)生的現(xiàn)象。,第二部分 核酸操作技術(shù),一、核苷酸序列測定 二、Western-blotting、Northern-blotting 三、PCR,一、核酸的序列測定,Sanger：雙脫氧鏈終止法和Gilbert：化學法 雙脫氧鏈終止法的技術(shù)基礎(chǔ)： 、凝膠電泳分離DNA單鏈片段時，小片段移動快，大 片段移動慢。 、用合適的聚合酶可以合成出與單鏈DNA互補的鏈。 、反應(yīng)體系中包括：單鏈模板、四種脫氧核苷酸、合 適的引物、一定比例的2 , 3 -雙脫氧核苷三磷 酸（ddNTP)以及若干種適量的無機離子。,核酸化學,酶法測定DNA序列的原理,DNA序列測定的自動化,二、核酸印跡,Southern-blotting：Southern印跡。指經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到合適的固相載體上，再通過特異性探針的雜交來檢測被轉(zhuǎn)移的DNA片段的一種技術(shù)。 Northern