1、第二章 基因工程,一、緒論 1、什么是基因？如何分類？什么是基因表達(dá)？ 2、什么是基因工程？它產(chǎn)生的背景是什么？它的應(yīng)用前景如何？,1、什么是基因？如何分類？ 什么是基因表達(dá)？,基因，在希臘語中是“給予生命”之意，1909年，丹麥生物學(xué)家首先使用名詞“基因”代替“遺傳因子” 這個術(shù)語。,1）經(jīng)典的基因概念（Theory of the gene） 1926 T. H. Morgan,基因是染色體上的實體,基因象鏈珠(bead)一樣，孤立地呈 線狀地排列在染色體上,基因是 (Three in one) ；,功能(functional unit) 突變(mutation unit) 交換(cross

2、-over unit),“三位一體”的,最小的 不可分割的 基本的,遺傳單位,(1926 T. H. Morgan),1910年始做果蠅雜交試驗，發(fā)現(xiàn)“連鎖遺傳規(guī)律” , 并概括提出“基因論”,1、什么是基因？如何分類？ 什么是基因表達(dá)？,2）后來順反子理論 和操縱子理論的提出對經(jīng)典的基因概念做了重要修正與發(fā)展。 順反子理論的重要理論基礎(chǔ)： “一個基因一個酶”假說 1941 Beadle & Tatum 基因的化學(xué)本質(zhì)就是DNA分子 1944 Avery. O.T,順反子學(xué)說：一個順反子就是一個基因，這個基因或者編碼蛋白質(zhì)，或者編碼RNA分子。 在一個順反子內(nèi)，有若干個突變單位 突變子 在一個

3、順反子內(nèi)，有若干個交換單位 交換子 順反子學(xué)說徹底否定了基因是決定遺傳性狀的功能單位和突變、重組的最小單位這樣三位一體的概念。,one gene one function (Ribozyme, Abzyme, rDNA, tDNA.),one gene one enzyme,Lac. Operon,操縱子理論 (Lactose operon 1961. Jacob, Monod ),基因功能的表現(xiàn)是若干基因組成的信息表達(dá)的整體行為,one gene one peptide,1、什么是基因？如何分類？ 什么是基因表達(dá)？,3）基因：是一段含有特定遺傳信息的核苷酸序列（或核酸片段），它是控制生物性狀

4、的功能和結(jié)構(gòu)單位。,1、什么是基因？如何分類？ 什么是基因表達(dá)？,4）從分子水平來說，基因有三個基本特性。,基因可自體復(fù)制 1953年Watson-Crick 提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。說明了半保留復(fù)制機制，兩股DNA彼此分開，以每一股為模板，按堿基配對的規(guī)則，各自配上一股新的DNA，復(fù)制便告完成。,基因的一般特點,基因決定性狀 生物體的表（現(xiàn)）型（phenotype）是指有機體可見的或可計算的外在性質(zhì)，而基因型（genotype）是指控制這些表型的遺傳因子。,基因的一般特點,基因突變 基因通常是一個穩(wěn)定的遺傳單位，但它也可能發(fā)生可遺傳的變異，這種變異叫基因突變（mutation）。突變以后

5、的基因以新的形式穩(wěn)定遺傳。攜帶突變基因的生物體叫突變體（mutant），攜帶正?；虻纳矬w叫野生型（wild type)。,基因的一般特點,5）、根據(jù)是否轉(zhuǎn)錄和翻譯功能可分三類： 一類是既有轉(zhuǎn)錄功能又有翻譯功能的基因，這類基因是指編碼酶和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因及編碼阻遏蛋白的調(diào)節(jié)基因（統(tǒng)稱為蛋白質(zhì)基因）； 第二類是只有轉(zhuǎn)錄功能而沒有翻譯功能的基因，包括編碼tRNA和rRNA的基因； 第三類是既不轉(zhuǎn)錄也不翻譯的基因，包括啟動基因、操縱基因、增強子等（有時也把它稱為調(diào)控基因）。,6）所以基因表達(dá)不能說就是遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯從（DNA）傳遞到蛋白質(zhì)的過程。 基因表達(dá)：是基因表現(xiàn)其生物功能所經(jīng)歷的一

6、系列分子轉(zhuǎn)化和相互作用的過程。,2、什么是基因工程？它產(chǎn)生的背景是什么？它的前景如何？,（1）、基因工程：應(yīng)用DNA重組技術(shù)，按照人們的意愿，在基因水平上改變生物的遺傳性狀，創(chuàng)造新生物物種，通過工程化為人類提供有用產(chǎn)品及服務(wù)的技術(shù)。,遺傳工程：是包括基因工程在內(nèi)的人工改造生物遺傳性狀的全部技術(shù)； DNA重組技術(shù)：是采用酶法，將不同來源 DNA進行體外切割與連接構(gòu)成雜種DNA分子： 分子克隆：主要是指DNA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程。 三者之間有聯(lián)系，但是有不同。,（2）產(chǎn)生的背景： 一方面是科學(xué)發(fā)展的必然要求（當(dāng)時育種工作、癌等的治療都要求科技應(yīng)有所突破）； 另一方面是有關(guān)基因結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)

7、理論研究的重大突破和技術(shù)的必然結(jié)果。,（3） 基因工程的成果和發(fā)展前景,A、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生 B、基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè) C、基因工程與環(huán)境保護,A 基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生,基因工程藥品的生產(chǎn),許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來源限制產(chǎn)量有限，其價格往往十分昂貴。 微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應(yīng)藥物成分的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞內(nèi)，讓它們產(chǎn)生相應(yīng)的藥物，不但能解決產(chǎn)量問題，還能大大降低生產(chǎn)成本。,基因工程胰島素（一）,胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價格之高可想而

8、知。,胰島素分子結(jié)構(gòu),基因工程胰島素（二）,將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不但解決了這種比黃金還貴的藥品產(chǎn)量問題，還使其價格降低了30%-50%!,胰島素生產(chǎn)車間,其它基因工程藥物,人造血液、白細(xì)胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，均為解除人類的病苦，提高人類的健康水平發(fā)揮了重大的作用。,人造血液及其生產(chǎn),B 基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè),運用基因工程技術(shù)，不但可以培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗性好的農(nóng)作物及畜、禽新品種，還可以培養(yǎng)出具有特殊用途的動、植物。,轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄,轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯,不會引起過敏的轉(zhuǎn)基因大豆,超級動

9、物,導(dǎo)入貯藏蛋白基因的超級羊和超級小鼠,特殊動物,導(dǎo)入人基因具特殊用途的豬和小鼠,C 基因工程與環(huán)境保護,基因工程做成的DNA探針能夠十分靈敏地檢測環(huán)境中的病毒、細(xì)菌等污染。,1t水中只有10個病毒也能被DNA探針檢測出來,基因工程在環(huán)境監(jiān)測上的應(yīng)用,基因工程與環(huán)境污染治理,基因工程做成的“超級細(xì)菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質(zhì)。,通常一種細(xì)菌只能分解石油中的一種烴類，用基因工程培育成功的“超級細(xì)菌”卻能分解石油中的多種烴類化合物。有的還能吞食轉(zhuǎn)化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質(zhì)。,A 重組DNA技術(shù)的理論基礎(chǔ),二 基因工程的基本原理,19世紀(jì)中 孟德爾 豌豆雜交試驗 遺傳因子 經(jīng)典遺傳

10、學(xué),20世紀(jì)初 摩爾根 果蠅雜交實驗 基因 基因?qū)W,1944年 艾弗瑞 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗 遺傳物質(zhì)DNA,1973年 伯格-杰克森-考恩-鮑耶 DNA分子體外拼接,分子遺傳學(xué),1953年 沃森-克瑞克 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) 分子生物學(xué),基因工程,B 基因的分子生物學(xué),二 基因工程的基本原理,C 基因工程的基本原理,提高外源基因的劑量分子遺傳學(xué)原理,篩選修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如：啟動子、,增強子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列等,列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等,分子生物學(xué)原理,修飾構(gòu)建蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件，如：SD序,基因工程菌（微型生物反應(yīng)器）的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn),生化工程學(xué)原理,分

11、子生物學(xué)原理,D 基因工程的支撐技術(shù),核酸凝膠電泳技術(shù),核酸分子雜交技術(shù),細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù),DNA序列分析技術(shù),寡核苷酸合成技術(shù),基因定點突變技術(shù),聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù),三 基因工程的基本條件,C 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞,B 用于基因克隆的載體,A 用于核酸操作的工具酶,A 用于核酸操作的工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶,DNA連接酶,DNA聚合酶,核酸酶,核酸修飾酶,（一）、工具酶：基因工程中所使用的酶類。 1、限制酶：凡能識別和切割雙螺旋DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶類，全稱是限制性核酸內(nèi)切酶（1）、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：,寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象（R / M體系） 因此發(fā)現(xiàn)了兩種酶：

12、 核酸內(nèi)切酶：破壞外源DNA，使之迅速降解； 甲基化酶：保護自身DNA不受限制。 1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出Hind II和Hind III,限制性核酸內(nèi)切酶的生物功能,識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈；,主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵,（2）限制性核酸內(nèi)切酶的命名,屬名 種名 株名,H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌d株,同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶,根據(jù)屬名和種名相結(jié)合的原則，即取細(xì)菌屬名的第一個字母（大寫）+種名的前兩個字母（小寫）表示。（若有株名時，用株名

13、第一個字母置于三字母后）,（3） 核酸限制性內(nèi)切酶的類型 根據(jù)識別序列和切割位點的一致性，分為3類： 其中II型酶的核酸內(nèi)切酶活性和甲基化作用是分開的，且具有序列特異性，在基因克隆中廣泛使用。,II 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性,識別雙鏈DNA分子中4 - 8對堿基的特定序列,大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè),識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu),5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的識別序列,EcoR I的切割位點,具有很強的底物專一性，其底物只能是雙鏈DNA分子，對單鏈RNA及雙鏈DNA-RNA

14、雜交分子均不起作用；,EcoRI等產(chǎn)生的5粘性末端,5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5,EcoRI 37 ,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等產(chǎn)生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

15、5,PstI 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等產(chǎn)生的平頭末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5,(4)

16、 ：影響限制酶活性的因素： 底物的純度；純度高則酶活性強 DNA的甲基化程度；甲基化程度高則酶活性弱 DNA分子結(jié)構(gòu)； 環(huán)狀雙螺旋DNA分子較線性DNA穩(wěn)定，所需酶量較線性多。 反應(yīng)溫度； 大多數(shù)為37 ，特別：SmaI：25，ApaI：30，MaeI：45 反應(yīng)緩沖液。 終止限制酶反應(yīng)的方法：加熱失活，65保溫5分鐘；如是耐熱酶，則可用脲、SOS、及胍等變性劑使之失活。,2、DNA連接酶及T4-DNA連接酶,問題：什么是連接酶？兩種連接酶各有什么特點？ 能催化DNA片段5-磷?；c3-羥基形成磷酸二酯鍵的酶。 T4-DNA連接酶是T4-噬菌體編碼的一種重要連接酶 特點： DNA連接酶只能封閉

17、缺口，而不能封閉裂口；只能連接粘性末端，不能連接平整末端。 T4-DNA連接酶既能連接粘性末端，又能連接平整末端。但用量大。,DNA連接酶(ligase):催化2條鏈3-OH和5-P之間形成磷酸二酯鍵。 DNA連接酶的活性 能封閉nick，而非gap 反應(yīng)溫度：37為最佳溫度 26反應(yīng)4小時 4過夜,3、DNA聚合酶：將脫氧核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3- OH末端，催化核苷酸的聚合。 （1） 大腸桿菌DNA聚合酶I(E. coli. DNA Pol I) 特點： 5-3DNA聚合酶活性：Mg2+、單鏈DNA模板、 3- OH末端 3-5 外切酶活性：識別消除不配對堿基 5-3外切酶

18、活性,作用 DNA缺口轉(zhuǎn)移,（2） 大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段) 特點 5-3聚合酶 3-5外切酶 應(yīng)用 用同位素標(biāo)記DNA片段的末端 補平粘末端 合成cDNA第二鏈 Sanger雙脫氧法進行序列測定 定位突變,B 用于基因克隆的載體,問題：什么是載體？做為載體必須符合哪些條件？基因 工程為什么要用載體？什么是受體、克隆和重組體（重組子）？ 載體：能將目的基因運載進生物細(xì)胞并在其中自我復(fù)制的遺傳因子。,載體的功能,運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞,為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力,為外源基因的擴增或表達(dá)提供必要的條件,載體應(yīng)具備的條件, 在細(xì)胞中能自我復(fù)制，即本身是復(fù)制子(可繁

19、殖性)； 具有一種或多種限制酶的單一切割位點，并在此位點中插入外源基因片斷后，不影響其本身的復(fù)制功能(可利用性)； 在基因重組中有1-2個篩選標(biāo)記從而容易進行選擇(具有便利性)； 分子小，多拷貝，安全性好，適應(yīng)性強，容易控制，便于表達(dá)。,在基因工程中，載體一般是用天然質(zhì)粒或病毒為材料，經(jīng)過人工改造或重新構(gòu)建而成，改造的目標(biāo)： 1、質(zhì)粒改小(增加有效裝載量和拷貝數(shù)) 2、減少相同的限制酶切點，使載體適合于多種限制性酶的切割 3、引入強的復(fù)制原點，構(gòu)建克隆載體 4、引入強的啟動子和其它表達(dá)序列，構(gòu)建表達(dá)載體。 5、引入兩種不同的復(fù)制原點，構(gòu)建穿梭載體。,1、質(zhì)粒載體（Plasmid Uector）

20、：,質(zhì)粒的基本特征,質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復(fù)制、并,被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子,質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中,絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的,絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，,即cccDNA,質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 300 kb,質(zhì)粒的自主復(fù)制性,質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進行自主復(fù)制,質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系,根據(jù)在每個細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃?兩大復(fù)制類型：,嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 1 - 3 拷貝,松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒 10 - 60 拷貝,質(zhì)粒的不相容性,任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)

21、粒，不能同時存在于,一個細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì),以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：,ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容,粒組成不相容性群,粒的不相容性，不相容性的質(zhì),質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性,革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾?接合型質(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到,另一個細(xì)胞（接合作用），如F、 R 、 Col質(zhì)粒等,非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用(用做基因工程的載體更為安全),值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒,的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由 bom 和,mob 基因決定,攜帶特殊的遺傳標(biāo)記,野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多

22、個遺傳標(biāo)記基因，這,使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：,這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義,質(zhì)粒的分類,人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：,高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)1000-3000 擴增基因,低拷貝質(zhì)粒 來自pSC101 拷貝數(shù)小于10 表達(dá)某些毒性基因,溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì),測序質(zhì)粒 含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker,整合質(zhì)粒 裝有整合促進基因及位點 便于外源基因的整合,穿梭質(zhì)粒 裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆,表達(dá)質(zhì)粒 裝有強化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件,探針質(zhì)粒

23、 裝有報告基因 便于啟動子等元件的克隆篩選,PBR322質(zhì)粒： PBR322質(zhì)粒是大腸桿菌質(zhì)粒載體，有萬能質(zhì)粒載體之稱。它是由PSF2124、PMB8、PSC101三個親本質(zhì)粒經(jīng)過復(fù)雜的重組構(gòu)成的。 PSF2124帶有氨芐青霉素抗菌素基因（Ampr）； PMB8帶有ColE松馳型復(fù)制子； PSC101帶有一個四環(huán)素抗性基因（Tetr）。 因此PBR322質(zhì)粒是一個帶有（Ampr）和（Tetr）標(biāo)記的松馳型質(zhì)粒載體。,重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體,松弛型復(fù)制,pBR322： 2.6x106道爾頓,拷貝數(shù) 50 - 100 / cell,用于基因克隆,2、噬菌體或病毒DNA,噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生

24、物，能高效高特異性地侵染,宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏,起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。,噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的載體，因為：,高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞,自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴增,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l 噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu),l 噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成,l-DNA全長48502個核苷酸,l-DNA上至少有61個基因,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期,E.coli,吸附,LamB受體,注入,復(fù)制,包裝,裂解,大腸桿菌的 l 噬菌體D

25、NA,l 噬菌體生物學(xué)特性： 溶源狀態(tài),l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶源狀態(tài)。 人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶源狀態(tài)。 DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進入溶菌狀態(tài),大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度,野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50

26、%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點,野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不,利于重組操作，必須刪除至1 - 2個,同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一,些單一的酶切位點,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記,與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此,加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容,l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：,免疫功能類標(biāo)記,顏色反應(yīng)類標(biāo)記,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇

27、標(biāo)記 lacZ,lacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化,無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基,因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能,合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn),生藍(lán)色透明斑。,l-DNA作為載體的優(yōu)點：,l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌,l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量,重組l-DNA分子的篩選較為方便,重組l-DNA分子的提取較為簡便,l-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達(dá),外源基因,受體：用于擴增載體及目的基因 的細(xì)胞。 克?。耗康幕虻臄U增過程。 重組體（重組子）：攜帶重組DNA分子的受體細(xì)胞。 對受體要

28、求： 對人體無害： 繁殖能力強、生長速度快、從而在短時間內(nèi)能產(chǎn)生 大量的后代，得到大量的基因拷貝和產(chǎn)物； 限制系統(tǒng)缺陷，對外來DNA不降解； 有蛋白質(zhì)的加工修飾能力。如糖基化、氨基化和磷酸化等。,C 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞,受體細(xì)胞也叫宿主細(xì)胞。有原核受體細(xì)胞、真核受體細(xì)胞、動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞（其實也是真核受體細(xì)胞） 原核受體細(xì)胞：常見的是大腸桿菌：E.coli C600，E.coli HB101，E.coli RR1，E.coli X1776 枯草桿菌、假單胞菌、鏈球菌和放線菌也可作宿主細(xì)胞 動物病毒載體的受體細(xì)胞是動物細(xì)胞，如痘苗病毒載體所用的小鼠 L 細(xì)胞、SV40病毒載體所用的猴腎

29、細(xì)胞、腺病毒載體所用的 Hela 細(xì)胞。,四、基因工程的基本操作程序,基因工程是將一個基因片斷插入到一個載體中，構(gòu)成重組體，再導(dǎo)入宿營主細(xì)胞進行復(fù)制擴增，即進行無性繁殖。因此，任何DNA克隆都包括四個步驟： 獲取載體裁DNA和目的基因把目的基因和載體在體外連接將人工構(gòu)建的重組DNA 導(dǎo)入宿主細(xì)胞進行擴增選擇與鑒定重組的克隆。,基因工程的操作過程,切,接,轉(zhuǎn),增,檢,（一）、目的基因的獲得,問題：什么是目的基因？什么是外源基因？獲得目的基因的方法和原理是什么？ 目的基因：我們通常將那些已被或要被分離、改造、擴增或表達(dá)的特定基因或片斷。 外源基因：把插入到載體內(nèi)的那個特定的DNA片斷。 關(guān)系：外源

30、DNA不一定含有目的基因。,獲得目的基因的方法： 1、物理法： 原理是從幾個方面來利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基G和C 配對，A和T配對的特性差別，以達(dá)到生物基因分離目的基因的目的。 （1）、密度梯度離心法： （2）、單鏈酶法： （3）、分子雜交法： 2、化學(xué)法合成基因：,化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,全基因合成,化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：,小片段粘接法：,混合退火,根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段,T4-DNA連接酶連接,克隆入合適的載體,化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,補釘延長法：,混合退火,根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-1

31、5堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段,T4-DNA連接酶連接,克隆入合適的載體,Klenow酶聚合,化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,大片段酶促法：,混合退火,根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段,T4-DNA連接酶連接,Klenow酶聚合,條件：已知某種基因的核苷酸序列或者根據(jù)某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列。 缺點：反應(yīng)專一性不強，副反應(yīng)多，合成片段越長分離純度化困難，產(chǎn)率越低，而且合成能力有限一般局限于150-200bp。,3、從基因文庫（gene library）中分離基因,基因文庫（gene library）： 是指匯聚某一生物染色體所有DNA序列的

32、重組DNA群體（轉(zhuǎn)化子群）。它是將一種生物的基因儲存在可以長期保存的重組體中。 根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為： 基因組文庫（含有全部基因） cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）,3、從基因文庫（gene library）中分離基因,基因探針：是一段帶有放射性或非放射但有其它類似放射性標(biāo)記的與待查基因或其鄰近區(qū)段的核苷酸順序互補的核苷酸片斷。,基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略,用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA,用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA,在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時段的mRNA,種類不同（即基因表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫,一般還有

33、組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA,文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫,鳥槍法：先用物理方法(如剪切力、超聲波等）或酶化學(xué)方法（如限制性內(nèi)切核酸酶）將生物細(xì)胞染色體DNA切割 成為基因水平的許多片段，繼而將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合，將重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌擴增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結(jié)合篩選方法，從眾多的轉(zhuǎn)化子菌株中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。,基因文庫的構(gòu)建程序,基因組DNA的制備,為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性， 用于基因組文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量,避免過度的斷裂。,基因文庫的構(gòu)建程序,基因組DNA的切割,用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和,限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：,第一保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū),第二，保證DNA片段大小均一,超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工