1、肽類藥物的含量測(cè)定方法,背景：多肽類藥物及其主要優(yōu)勢(shì)人體的生長(zhǎng)和發(fā)育都離不開多肽，多肽是調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能和細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。多肽類藥物作為藥物開發(fā)的主要方向，它包括多種類型，常見的多肽類藥物有如下幾種 .多肽類疫苗：多肽類疫苗的研制為人類攻克肝炎、艾滋病 等疾病帶來了希望。 .抗腫瘤多肽類藥物：腫瘤危害人類的生存，其產(chǎn)生是多方 面因素共同作用的結(jié)果，但歸根到底是癌基因表達(dá)的問題。多肽類抗癌藥物由于其能夠成為腫瘤基因表達(dá)時(shí)的調(diào)控因子，因而成為了抗癌藥物研究的新希望。 .抗病毒類多肽藥物：一般來說，病毒感染細(xì)胞的過程包括以下幾個(gè)主要階段：吸附、自我復(fù)制、重新組合、釋放病毒等?？共《径嚯耐ǔＷ饔糜诓《疚?/p>

2、和病毒復(fù)制兩個(gè)階段，通過與宿主細(xì)胞特異性結(jié)合或者病毒蛋白酶結(jié)合來發(fā)揮作用。,一 、酸堿滴定法,示例：苯酪酞的測(cè)定,測(cè)定方法：取本品約0.5g精密稱定，加中性乙醇（對(duì)酚酞指示液呈中性）60ml，振搖，溶解后加酚酞指示液數(shù)滴，用氫氧化鈉滴定（0.1mol/l)，即可。,二、 紫外分度光度法,示例：五肽胃泌素含量測(cè)定,五肽胃泌素為白色或類白色粉末。本品能促進(jìn)胃酸、胃蛋白酶及內(nèi)因子的分泌，其促胃酸分泌作用相當(dāng)于內(nèi)源性胃泌素的1/4，作用可持續(xù)1040分鐘。臨床上主要用于胃酸分泌機(jī)能的檢查。,方法原理： 供試品加0.01mol/l氨溶液定量稀釋，制成供試液，置紫外可見分光光度計(jì),于280nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸

3、收度，計(jì)算出其含量。 試劑： 氨溶液（0.01mol/l） 標(biāo)準(zhǔn)品：e1%1cm 為70計(jì)算 儀器設(shè)備： 紫外可見分光光度計(jì),注：分光光度法應(yīng)以配制供試品的同批溶劑為對(duì)照，采用1cm的石英吸收池。以吸收度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，一般供試品的吸收度讀數(shù)，以在0.3-0.7之間的誤差較小。儀器的狹縫波帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測(cè)得的吸收度偏低。狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)供試品的吸收度不再增加為準(zhǔn)。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測(cè)定供試品的吸收度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，再計(jì)算含量。,三、效價(jià)測(cè)定法,實(shí)例（1）：抑肽酶效價(jià)的測(cè)定,抑肽酶(trasylol，別名：抑胰肽酶、屈來密

4、多) 能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰臟中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。臨床用于預(yù)防和治療急性胰腺炎、纖維蛋白溶解引起的出血及彌漫性血管內(nèi)凝血。還可用于抗休克治療。在腹腔手術(shù)后，直接注入腹腔可預(yù)防腸粘連。,抑肽酶通過酶上的絲氨酸活性部分，形成抑肽酶-蛋白酶復(fù)合物而達(dá)到抑制作用。然而與不同的蛋白酶結(jié)合，顯示出不同的離解常數(shù)。與胰蛋白酶的結(jié)合最牢固與人體纖溶酶的結(jié)合不很牢固。,（1）底物溶液的制備,(2) 胰蛋白酶稀釋溶液的制備,精密量取胰蛋白酶溶液1ml，用硼砂氯化鈣緩沖液（ph 8.0）稀釋成20ml，室溫放置10min，置于冰浴中。,取n-苯甲酰-l-精氨酸乙酯鹽酸鹽171.

5、3mg，加水溶解并稀釋至25ml。臨用時(shí)配制。胰蛋白酶溶液的 制備 取胰蛋白酶對(duì)照品適量，精密稱定，加鹽酸滴定液（0.001mol/l）溶解并制成每1ml中約含0.8單位（每1ml中約含1mg）的溶液，臨用時(shí)配制并置于冰浴中。,(3) 供試品溶液的制備,取本品適量，精密稱定，加硼砂一氯化鈣緩沖液（ph 8.0）溶解并制成每1ml中約含1.67單位（每1ml中約含0.6mg）的溶液，精密量取0.5ml與胰蛋白酶溶液2ml，再用硼砂一氯化鈣緩沖液（ph 8.0）稀釋成20ml，反應(yīng)10分鐘，置冰浴中（2小時(shí)內(nèi)使用）。,(4) 測(cè)定法,取硼砂氯化鈣緩沖液（ph 8.0）9.0ml與底物溶液1.0ml

6、，置25ml燒杯中，于250.5恒溫水浴中放置35分鐘，在攪拌下滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）調(diào)節(jié)ph值為8.0，精密加入供試品溶液（經(jīng)25保溫35分鐘）1ml，并立即計(jì)時(shí)，用1ml微量滴定管以氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）滴定釋放出的酸，使溶液的ph值始終保持在7.98.1。每隔60秒讀取ph值恰為8.0時(shí)所消耗的氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）的體積（ml），共6分鐘。另精密量取胰蛋白酶稀釋溶液1ml，按上法操作，作為對(duì)照（重復(fù)一次）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，消耗的氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）為縱坐標(biāo)作圖，應(yīng)為一條直線。供試品和對(duì)照兩條直線應(yīng)基本重合，求出每秒鐘消耗氫氧化鈉滴定

7、液（0.1mol/l）的體積（ml），按下式計(jì)算。,每1mg抑肽酶的效價(jià)（單位）,式中 4000為系數(shù)； w為抑肽酶制成每1ml中約含1.67單位時(shí)的酶量，mg； n1為對(duì)照測(cè)定時(shí)每秒鐘消耗的氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）的體積，ml； n2為供試品溶液每秒鐘消耗氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）的體積，ml； 2為供試品溶液中所加入胰蛋白酶的量為對(duì)照測(cè)定時(shí)的2倍； f為氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）校正因子。,效價(jià)單位定義 能抑制一個(gè)胰蛋白酶單位每秒鐘能水解1mol的n-苯甲酰-l-精氨酸乙酯（baee）為一個(gè)胰蛋白酶單位（microkatal）的活力稱為一個(gè)抑肽酶活力單位（epu）

8、。每1epu的抑肽酶相當(dāng)于1800kiu。,注意事項(xiàng)： （1）本實(shí)驗(yàn)測(cè)定原理：在一定條件下（ph8.0，25），胰蛋白酶可使n-苯甲酰-l-精氨酸乙酯水解為n-苯甲酰-l-精氨酸，使溶液ph下降，當(dāng)加入氫氧化鈉滴定后，使溶液ph又回到8.0，水解繼續(xù)進(jìn)行。 （2）當(dāng)胰蛋白酶中加入抑肽酶后，使50%的胰蛋白酶活性被抑制，剩余的胰蛋白酶繼續(xù)與底物進(jìn)行水解反應(yīng)，用氫氧化鈉滴定釋放出的酸，使ph始終維持7.98.0，在一定時(shí)間內(nèi)，根據(jù)根據(jù)樣品消耗的氫氧化鈉（0.1mol/l）的體積（ml)算出活力單位。,實(shí)例（2）桿菌肽效價(jià)測(cè)定： 利用桿菌肽能夠抑制微生物生長(zhǎng)特性，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)微生物產(chǎn)

9、生抑菌圈面積的大小，從而得到待測(cè)樣品相對(duì)與標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià),實(shí)例（3）縮宮素的效價(jià)測(cè)定 利用縮宮素的能夠改變小鼠子宮的收縮程度，來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)子宮收縮程度進(jìn)行比較，從而得到該藥物相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。,總結(jié)： 在進(jìn)行多肽藥物含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)可以采用了兩種形式： 第一種屬于比較精準(zhǔn)的定量如酸堿滴定法和紫外分光光度法。這兩種方法都是利用多肽分子結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)。方法一利用游離的氨基或羧基，使多肽表現(xiàn)出酸堿性，可以利用低濃度酸或堿進(jìn)行滴定；方法二利用某些特性的官能團(tuán)來進(jìn)行定量。因此再要進(jìn)行對(duì)某種多肽物質(zhì)進(jìn)行定量時(shí)，可以從結(jié)構(gòu)特性下手，利用特性化學(xué)反應(yīng)或者物理特性進(jìn)行定量。 第二種屬于一種比較抽象的定量方式效價(jià)測(cè)定。跟酶活力單位類似是一個(gè)可以隨人為規(guī)定變化而變化的