1、分子生物學(xué)研究方法和技術(shù),湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心 詹 慶 才 電話：84691351 Email:,本人基本情況,1984年獲湖南農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)學(xué)士學(xué)位。1987年獲中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所理學(xué)碩士學(xué)位，專業(yè):分子遺傳。 1999年11月-200年11月 受國(guó)家科技部派遣，在日本農(nóng)林水產(chǎn)省北海道國(guó)家農(nóng)業(yè)研究中心博士后特別研究員；主要從事基因定位和功能基因的篩選。 年：主要從事水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理研究；水稻分子育種技術(shù)研究。 4：主要從事雜交水稻種子純度快速鑒定技術(shù)研究；水稻品種指紋研究；基因定位和分子育種技術(shù)研究。,1、分子生物學(xué)的發(fā)展歷程 1871年，首次發(fā)現(xiàn)DNA（鮭精DNA）。1943年，

2、證明DNA為遺傳分子，而不是蛋白（1944，O T Avery） 1953年，DNA雙螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或諾貝爾生理學(xué)、醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）。從而為分子生物學(xué)這一學(xué)科奠基。1961年，合成mRNA，破譯第一個(gè)遺傳密碼（M W Nirenberg（美），1968年獲諾貝爾生理學(xué)、醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）基礎(chǔ)研究的創(chuàng)新，與推動(dòng)人類文明的進(jìn)步。（以上被稱為理論上的三大發(fā)現(xiàn)）,1970年，分離出第一個(gè)限制性內(nèi)切酶（W Arber（瑞士），1978年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)） 1970年，Baltimore和Temin發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶 長(zhǎng)期的基礎(chǔ)研究積累迎來(lái)了突飛猛進(jìn)的高潮。 1

3、973年，Cohen把質(zhì)粒作為基因工程的載體使用 基礎(chǔ)研究向應(yīng)用研究的拓展。 （以上被稱為生物工程技術(shù)的的三大發(fā)明）,3個(gè)事例： （1）1976年，重組DNA成功（H Boyer和S N Colen，1981年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）勇敢的科學(xué)精神。 （2）1982年，美國(guó)一制藥公司在2000升發(fā)酵液中提取出100克精制胰島素。相當(dāng)于從1600磅動(dòng)物胰腺中的提取量效率、成本、質(zhì)量、競(jìng)爭(zhēng)。 （3）荷蘭最早把分子生物學(xué)產(chǎn)品“豬牛痢疾疫苗”投放市場(chǎng)，比以上美國(guó)的胰島素早半年后來(lái)居上。,人類對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí),20世紀(jì) 個(gè)體 染色體 基因 DNA SNP 生物與非生物間的界限消失了！ 21世紀(jì) 基因克隆，拼結(jié)

4、組裝植物、動(dòng)物、嬰兒！,數(shù)、理、化相關(guān)學(xué)科,生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),滲透 交叉,近代生物學(xué),個(gè)性,共性,宏觀生物學(xué) （生態(tài)學(xué)為核心）,微觀生物學(xué) （分子生物學(xué)為核心）,細(xì)胞水平,分子水平,結(jié)構(gòu)生物學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)等新興學(xué)科發(fā)展,生物多樣性 研究,資源保護(hù)與 利用,人類生態(tài)環(huán)境的保護(hù) 工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展,現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展,分子生物學(xué),分子生物學(xué)的延伸,2 分 子 生物 學(xué) 的 概 念,2.1 分子生物學(xué)的定義 2.2 分子生物學(xué)的三大原則 2.3 分子生物學(xué)研究的三大主要領(lǐng)域 2.4 分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科,2.1 分子生物學(xué)的定義,Molecular biology is the st

5、udy of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation. 分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭示生物世界的奧秘，由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。,分子生物學(xué)與生物化學(xué)之間的關(guān)系與區(qū)別,分子生物學(xué)研究生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及信息傳遞過(guò)程，從分子水平研究生命現(xiàn)象。,

6、生物化學(xué)生物體內(nèi)的化學(xué)運(yùn)動(dòng)，包括化學(xué)組成、變化、結(jié)構(gòu)與功能，生物分子間的物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)換過(guò)程。,分子生物學(xué)生物化學(xué), 構(gòu)成生物大分子的單體是相同的, 生物遺傳信息的表達(dá)的中心法則相同,高級(jí)結(jié)構(gòu),生物大分子之間的互作,2.2 分子生物學(xué)的三大原則,共同的核酸語(yǔ)言 共同的蛋白質(zhì), 生物大分子單體的排列（核苷酸，氨基酸）,結(jié) 構(gòu) 生 物 學(xué),基因分子生物學(xué),生物技術(shù)理論 論與應(yīng)用,2.3 分子生物學(xué)研究的三大主要領(lǐng)域,狹義的分子生物學(xué)分子遺傳學(xué),2.4 分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科,1839-1847年 Matthias Schleiden 3）保持一定的離子強(qiáng)度; 4）減少物理因素對(duì)核酸降解的機(jī)械剪

7、切力.,（二）防止核酸的生物降解,細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。 所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。,1. DNA酶抑制劑,1） 金屬離子螯合劑： DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉； 2） 陰離于型表面活性劑： 如SDS，該試劑除對(duì)核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。,2. RNA酶（RNAase)抑制劑,RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高

8、溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。,(2) DEPC(二乙基焦碳酸鹽) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。 作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。 使用注意： 1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大1001000倍。 2）容易降解，保存在4 或液氮中； 3）提RNA時(shí)，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。 4）劇毒。,（3) 肝素 （4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧釩核糖核苷復(fù)合物

9、(Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC),二 分離提取核酸的主要步驟,（一）細(xì)胞的破碎 1 高速組織搗碎機(jī)搗碎 2 玻璃勻漿器勻漿 3 超聲波處理法 4 液氮研磨法 5 化學(xué)處理法(SDS、吐溫80等） 6 生化法（溶菌酶、纖維素酶等）,（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。 分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時(shí)避免核酸降解。,常用方法： 1. 加入濃鹽溶液（如NaCl） 核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚； 2. 加入SDS S

10、DS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來(lái)的功能；,3 . 酚/氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對(duì)核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液時(shí)，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯仿：異戊醇=25：24：1）。,1）使用注意 酚通常是透明無(wú)色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。 2）安全操作 酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)

11、重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。,使用酚時(shí)應(yīng)注意,（三）核酸的沉淀,沉淀是濃縮核酸最常用的方法。 優(yōu)點(diǎn)： 改變核酸的溶解緩沖液； 重新調(diào)整核酸的濃度； 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。,1. 核酸沉淀的鹽類及濃度,2. 有機(jī)沉淀劑,（1）乙醇 優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。 缺點(diǎn)： 需要量大，一般要求低溫操作。,（2）異丙醇,優(yōu)點(diǎn)： 需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。 缺點(diǎn)： 易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70乙醇漂洗數(shù)次。,（3）聚乙二醇（PEG）,優(yōu)點(diǎn)： 可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相

12、對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對(duì)分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時(shí)，使用濃度與DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。,（4）精胺,精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。 原理是： 精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開，達(dá)到純化DNA的目的。,3. 核酸沉淀的溫度和時(shí)間,一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行。低溫長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用0冰水，10-15min， DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。,

13、(四）核酸的濃度測(cè)定,1. 紫外分光光度法測(cè)定DNA和RNA的含量 前提：核酸樣品要較純，無(wú)顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測(cè)定濃度應(yīng)大于0.25 g/ml 。 結(jié)論：在波長(zhǎng)260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單鏈DNA為37 g/ml；RNA為40 ug/ml。,紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度的操作步驟,a吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。 b分光光度計(jì)先用一定量的水校正零點(diǎn)。 c測(cè)定待測(cè)樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d計(jì)算濃度。 雙鏈DNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀

14、釋倍數(shù) 50； RNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù)40。 e分析純度。,A：測(cè)DNA： 純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260mOD230應(yīng)大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9時(shí)，表明有RNA污染。 2) 小于1.6時(shí)，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0時(shí)，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。,測(cè)定結(jié)果分析,B：測(cè)RNA 純的RNA樣品其OD260OD280應(yīng)介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應(yīng)大于2

15、.0。 1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說(shuō)明有蛋白質(zhì)或酚的污染； 2）比值大于2.0時(shí)，可能被異硫氰酸胍等污染； 3）OD260/OD230比值小于2.0時(shí)表明有小分子及鹽存在。,2. 溴乙錠熒光法測(cè)定核酸的含量,如果DNA和RNA的量很少或有較多雜質(zhì)的情況下，其含量可用溴乙錠熒光法測(cè)定。 原理：DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測(cè)DNA溶液濃度。 注意：此法的比較主要基于目測(cè)，是估計(jì)水平。,（五）核酸的保存,對(duì)

16、DNA保存： DNA樣品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存； 長(zhǎng)期保存樣品中可加入1滴氯仿。 對(duì)RNA 保存： RNA樣品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70 保存; 長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70,可保存數(shù)年。,總RNA提取,目 的 1了解某一特定組織或細(xì)胞某一特定mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如PCR、Northern blot等。 2了解某一特定組織或細(xì)胞全部mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如DD-PCR、基因芯片等。 3獲得某一特定組織或細(xì)胞全部mRNA，以便建立cDNA庫(kù)等。

17、4獲得某一特定組織或細(xì)胞全部RNA。 以上工作的前提是制備純凈且完整的RNA。,根據(jù)生物學(xué)“中心法則”原理，基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄與翻譯兩個(gè)階段。其中，由DNA到RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到各種因素的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)水平反映出某種或某些特定的因素對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)能力。 RNA主要由rRNA（占總量的80-85），tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占總量的10-15）以及mRNA（占總量的1-5）所構(gòu)成。理論上認(rèn)為每克組織（或108個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞）可提取5-10mg RNA。,提取總RNA的方法有多種，比如： 1) 酚/SDS法 2）采用Trizol試劑盒或類似的方法，稱為一步法，方便而快捷。缺點(diǎn)是RNA的獲得量偏低

18、，質(zhì)量不夠純凈。 3）超離心方法，可以獲得豐富且質(zhì)量高的RNA。缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)時(shí)間比較長(zhǎng)，要求離心過(guò)夜。 4）其它一些試劑盒，主要是利用某些特定的介質(zhì)吸附RNA，洗去其它雜質(zhì)，最后洗脫純凈的RNA?？梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)獲得純凈的RNA。但是價(jià)格比較昂貴。,植物總RNA提取(酚/SDS法 ),材料,液氮 研磨緩沖液：0.18mol/LTris 0.09mol/L LiCL 4.5mmol/L EDTA 1%（W/V）SDS 用HCL調(diào)PH至8.2,1mol/L Tris的配法：,在800 雙蒸水中溶解121克Tris堿，用濃鹽酸調(diào)PH值，混勻后加水至1升。,要獲得所需PH值的1M Tris HCL，可通過(guò)

19、將一定數(shù)量的10M HCL和1升Tris堿混合，如下表所示:,0.5M EDTA的配制：,在700ML雙蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH調(diào)PH8.0（1000ML 05M EDTA需加入20克NaOH），補(bǔ)加雙蒸水至1升。,TLE緩沖液平衡酚 TLE溶液: 0.2mol/LTris 0.1mol/L LiCL 5mmol/L EDTA 用HCL調(diào)PH至8.2，用等體積的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次,氯仿：異戍醇（24：1） 8MOL/L和2MOL/L LICL溶液（DEPC處理，焦碳酸二乙酯） 3MOL/L乙酸鈉（DEPC處理），將408

20、克NaAc.3H2O溶于水，用3MOL/L乙酸調(diào)PH5.2，補(bǔ)加水至1升95%乙醇DEPC處理水,試驗(yàn)步驟：,1、 用液氮冷卻研缽，取15g低溫冷凍的植物組織，迅速置于研缽中，不時(shí)加入液氮以防止研磨過(guò)程中葉片融化，充分研磨后，立即轉(zhuǎn)移到一個(gè)盛有150ML研磨緩沖液和50ml TLE緩沖液平衡酚的500ml離心管中。 2、 加入50ml氯仿：異戍醇，于50加熱20 min 。18000g, 4，離心20 min。,3、將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入50ml TLE緩沖液平衡酚的500ml，混勻，再加入50ml氯仿：異戍醇，18000g, 4，離心20 min。,4、用 TLE緩沖液平衡酚

21、抽提水相，直至兩面相間界面干凈為止，水相再以氯仿抽提。 5、 吸取上清液，加1/3體積的8M/L LiCL混合至終濃度為2M/L，4沉淀過(guò)夜，然后15000g，4， 離心20 min，沉淀以2-3ml 2M/L LiCL溶液沖洗。 6、沉淀以5ml水重溶，加入1/3體積的8M/L LiCL混合至終濃度為2M/L，于 4深沉RNA兩小時(shí)以上。,7、 15000g，4， 離心20 min，沉淀用2ml 2M/L LiCL溶液沖洗，重溶于2ml雙蒸水，加入200ul 3MOL/L乙酸鈉溶液和5.5ml無(wú)水乙醇，-20沉淀過(guò)夜或在干冰/乙醇中沉淀30 min。 8、18000g, 4，離心15min，

22、沉淀用1ml雙蒸水溶解，取10 ul稀釋至1ml測(cè)OD260和OD280,Trizol試劑盒方法,原 理 本實(shí)驗(yàn)類似于“異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用強(qiáng)RNA酶抑制劑異硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白質(zhì)變性。離心后，RNA選擇性地進(jìn)入無(wú)DNA和蛋白質(zhì)的水相。之后通過(guò)異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌等，便可得到較為完整與純潔的總RNA。,實(shí)驗(yàn)步驟 1取50毫克植物細(xì)嫩組織，加入1ml Trizol液，剪碎，快速勻漿。 222，靜置5min。 3加入氯仿0.2ml，顛倒15s。 422，靜置3min。 5離心：415000轉(zhuǎn)/分15min。 6取上清液0.45ml。

23、 7加入0.45ml異丙醇，混勻。,822，靜置10min。 9離心：415000轉(zhuǎn)/分10min。 10棄上液。 11加入1ml 4 75%乙醇。 12離心：410000轉(zhuǎn)/分5min。 13棄上液，真空干燥5min。 14用高壓消毒過(guò)的去離子水25ul水冰上溶解，-70保存。 15紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的含量：,取樣本5ul加入石英比色杯內(nèi)，加入蒸水1ml，充分混勻。與蒸鎦水對(duì)照。讀260nm、280nm兩個(gè)測(cè)得值，記錄。計(jì)算： OD260為1時(shí)，為40ug RNA，所以計(jì)算如下： 樣本RNA含量（ug/ul）= OD260*200*40/1000 當(dāng)OD值260/2801.8時(shí)，提示有

24、蛋白或酚的污染。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果 得到比較純凈的植物組織總RNA。 分光光度計(jì)讀數(shù) 260/280 值為 1.850.04。,植物RNA提取中的一些特殊方法,1、多酚類植物的RNA提?。?蘋果、棉花等多酚類植物提取RNA用TRIZOL一般提不出來(lái)。用下述方法提取的RNA純度不是特別高,但是用作northern足夠。 （1）1.5ml離心管用液N2冷凍后加入0.1g樣品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,劇烈振蕩1-2min,冰上放置5min.（2）4 12000rpm離心15min, 上清轉(zhuǎn)入新管,加氯仿異戊醇抽提一次（3）取600ul異丙醇,-20 沉淀20min.（4）

25、12000rpm離心10min（5）沉淀用70%乙醇洗（6）8000rpm 5min（7）沉淀晾干,溶于30ulDEPC水,2、 纖維組織： 心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于徹底破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，單位重量的組織RNA的含量就少，建議用盡可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纖維組織終RNA，由于纖維組織終RNA含量較少，可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量，并在液氮中將組織徹底磨碎，同時(shí)適當(dāng)減少溶解RNA的溶液體積。,3、 蛋白/脂肪含量高的組織：動(dòng)物的腦和某些特殊的植物組織中，脂肪或者蛋白的含量很高，可以采用TRNzol來(lái)提取此類樣品中的RNA。在該提取過(guò)

26、程中，用氯仿抽提后，如上清仍含白色絮狀物，必須用氯仿再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。使用TRNzol提取脂肪含量高的組織中RNA時(shí)，使用氯仿抽提后會(huì)分成油滴、水相（含RNA）、DNA中間層、有機(jī)相四層，應(yīng)用移液管小心吸取水相液體，避免吸到油滴層和DNA層。,4、 核酸/RNase含量高的組織：脾、胸腺、胰臟等組織的核酸和核酸酶含量很高，可以在液氮中碾磨組織，再快速勻漿。如果裂解液太粘稠（因?yàn)楹怂岷扛叩木壒剩?氯仿抽提不能有效分層，可以加入更多裂解液以解決此類問(wèn)題。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成則表明有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提，去除DNA污染。,5、 植物組織和真菌組織：

27、植物組織和真菌組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜，因此為了避免出現(xiàn)內(nèi)源酶作用使 RNA降解的現(xiàn)象，一般選擇在液氮條件下對(duì)植物或者真菌材料進(jìn)行碾磨。如果降解問(wèn)題不能解決，基本上是由于樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。許多植物和真菌中的內(nèi)含雜質(zhì)如多糖、多酚等都會(huì)殘留，因?yàn)檫@些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可以與RNA同時(shí)沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的RNA提取過(guò)程中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑（RNAplant）來(lái)去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。,病毒RNA提取方法,異硫氰酸胍提取法:實(shí)驗(yàn)步驟：1、 取200ul樣品數(shù)+陰性對(duì)照+陽(yáng)性對(duì)照個(gè)1.5ml滅菌eppendorf管。2、 加600ul異硫氰酸胍，然

28、后加入對(duì)照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻。3、 13000rpm離心15min。4、 在第3步離心快結(jié)束時(shí)，另取同樣多eppendorf管，加入400ul -20度預(yù)冷的異丙醇。,5、 取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結(jié)束往外拿的時(shí)候，管子盡量不要傾斜）轉(zhuǎn)移到第4步準(zhǔn)備的管中，顛倒混勻。6、 13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。7、 加600ul 75乙醇，顛倒數(shù)次以洗滌殘存異丙醇。,8、 13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。 9、 4000rpm離心10s，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干

29、，室溫干燥23min（不可過(guò)分干燥，防止下一步RNA不溶解）。 10、 加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5s，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ詈?小時(shí)內(nèi)使用，以免RNA降解）。,RNA提取注意事項(xiàng),一些RNA提取方法，在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對(duì)上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。1、 在核酸提取時(shí)，為了增加細(xì)胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒(méi)有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。,2、 有時(shí)在使用蛋白酶時(shí)，為了抑制核酸

30、水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應(yīng)溫度提高到5060，并將反應(yīng)時(shí)間縮短到1525min，但酶用量必須提高1020倍。溶菌酶使用時(shí)緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對(duì)酶有抑制。,3、 許多植物材料中富含酚，在細(xì)胞破碎時(shí)，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的醌類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP和巰基乙醇對(duì)降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提取時(shí)將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。,4、 許多生物材料在提取

31、核酸時(shí)，都會(huì)遇到多糖的污染問(wèn)題，具體表現(xiàn)為有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，沉淀很多，但復(fù)溶時(shí)，大量沉淀不溶，電泳觀察時(shí)核酸含量很低。,5、 在核酸提取時(shí)，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強(qiáng)于氯仿，但酚與水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸外，水相中還會(huì)殘留酚，而酚的存在將對(duì)核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)一定要用氯仿從抽提。6、 在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA時(shí)，更要避免劇烈操作。,7、 在沉淀核酸時(shí)可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時(shí)，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對(duì)擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。 8、 在提取核酸時(shí)，如樣品濃度低，則應(yīng)增加有機(jī)溶劑沉淀時(shí)間，70下30min;20過(guò)夜將有助于增加核酸的沉淀量。,9、 在核酸提取過(guò)程中有機(jī)溶劑沉淀后復(fù)溶時(shí)可加水因此時(shí)離子濃度可能較高，而到高度純化后低溫保存時(shí)最好復(fù)溶于TE緩沖液中，