1、細(xì)胞工程,Cell Engineering,Chapter3、植物組織與細(xì)胞培養(yǎng),31 植物細(xì)胞工程概述 32 植物組織培養(yǎng) 33 植物細(xì)胞培養(yǎng),31 植物細(xì)胞工程概述,311 植物細(xì)胞工程是細(xì)胞工程的一個重要分支學(xué)科。,312 植物細(xì)胞工程（plant cell engineering）,植物細(xì)胞工程（plant cell engineering）：是 在植物細(xì)胞全能性的基礎(chǔ)上，以植物細(xì)胞為 基本單位，在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或 人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性 按照人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種或 創(chuàng)制新種，或加速繁殖植物個體，或獲得有 用產(chǎn)物的過程。,313 植物細(xì)胞工程內(nèi)容：

2、,A、植物細(xì)胞工程（對象或內(nèi)容） 植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù) 植物細(xì)胞融合技術(shù) 植物細(xì)胞質(zhì)工程技術(shù) 植物染色體工程技術(shù) 轉(zhuǎn)基因植物技術(shù) B、植物細(xì)胞工程（目的或應(yīng)用） 植物細(xì)胞工程與育種 植物細(xì)胞工程與體外快速繁殖 植物細(xì)胞工程與優(yōu)質(zhì)種質(zhì)體外保存 植物細(xì)胞工程與藥物 食品工業(yè)化生產(chǎn),314 存在的理論與生產(chǎn)問題,植物細(xì)胞全能性的本質(zhì) 細(xì)胞分化機(jī)制和代謝途徑的調(diào)控 理論 培養(yǎng)細(xì)胞中的生理、后成雜種 問題 （rpigenetic）和遺傳的變異 體細(xì)胞雜交和有性雜交的比較 不親和性機(jī)制 細(xì)胞和組織培養(yǎng)方法 細(xì)胞器的分離和引入 技術(shù) 原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合 改進(jìn) 細(xì)胞的培養(yǎng)篩選及鑒定 花粉和花藥培養(yǎng)藥物生產(chǎn)的中

3、間試驗(yàn) 試管苗的大規(guī)模繁殖和生產(chǎn),315 植物組織培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別：,316 植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)內(nèi)容與分類：,試管苗、人工種子、單倍體誘導(dǎo) 植物組織培養(yǎng)技術(shù)（植物微繁殖技術(shù)） 原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交、 micro propagation 體細(xì)胞變異、種質(zhì)保存 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（植物細(xì)胞大量培養(yǎng)）植物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù) 根據(jù)對象不同，培養(yǎng)方式也可分為： 根據(jù)水平不同： 植株培養(yǎng)（plantlet culture） 植物胚胎培養(yǎng)(plant embryo culture) 細(xì)胞類型（體、生殖細(xì)胞） 植物器官培養(yǎng)(plant organ culture) 單倍體、二倍體和多倍體 植物組織培養(yǎng)

4、(plant tissue culture) 離體、人工無菌環(huán)境 愈傷組織培養(yǎng)(callus culture) 原生質(zhì)體培養(yǎng)(plant protoplast culture),32 植物組織與器官培養(yǎng),321 定義： 植物組織與器官培養(yǎng)是指在無菌條件下， 將離體的植物器官（如根尖、莖尖、葉、花、 未成熟的果實(shí)、種子等）、組織（如花藥組 織、胚乳、皮層等）、細(xì)胞（體細(xì)胞、生殖 細(xì)胞等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、 原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給 予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、潛 伏芽，或者長成新的完整植株的一種實(shí)驗(yàn)技 術(shù)。,323 發(fā)展歷程：,324 幾個概念,一、愈傷組織（c

5、allus）：是指由外植體組織增生的細(xì)胞 產(chǎn)生的一團(tuán)（大小、形狀、液泡化程度、胞質(zhì)含量和細(xì) 胞壁特性）不定型的疏散排列的薄壁細(xì)胞。（細(xì)胞水平 已分化，但沒有組織、器官水平分化，無組織結(jié)構(gòu)） 二、外植體（explantation）：是指植物組織培養(yǎng)中用來 進(jìn)行無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞和 原生質(zhì)體等。 三、（去）脫分化（dedifferentiation）：是指外植體在 人工培養(yǎng)條件下，經(jīng)多次細(xì)胞分裂后而失去原有分化狀 態(tài)，形成無結(jié)構(gòu)的愈傷組織或細(xì)胞團(tuán)的過程，使其回復(fù) 到胚性細(xì)胞的狀態(tài)。（胚性愈傷組織或類似組細(xì)胞、干 細(xì)胞）,四、再分化（redifferentiation）：是指

6、外植體可以由脫 分化狀態(tài)再度分化成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、 器官，甚至最終再生成完整植株。 五、繼代培養(yǎng)（subculture）：是指愈傷組織在培養(yǎng)基 上生長一段時間后，營養(yǎng)物枯竭，水分散失，并已積累 了一些代謝產(chǎn)物，此時需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng) 基上進(jìn)行培養(yǎng)的方式。 六、胚狀體（embryoid）：是指在外植體上產(chǎn)生了類似 于由生殖細(xì)胞發(fā)育來的合子胚（zygotic embryo）的體細(xì) 胞胚（somatic embryo）。它可來自植物的根、莖、葉 和花等組織的細(xì)胞，也可來自花藥壁及未成熟的幼穗等， 胚狀體的形成可通過愈傷組織途徑，也可不經(jīng)脫分化直 接從子葉和下胚軸部位形成。,胚

7、狀體的發(fā)育順序與受精卵發(fā)育極為相 似，經(jīng)過原胚 球形胚 心形胚 魚雷胚 子葉胚五個時期，最后形成 小植株，由于胚狀體和器官發(fā)生均可起 源于愈傷組織或直接來自于外植體，故 常?；煜?，可參見下表。,325 植物細(xì)胞全能性途徑：,分生組織直接分生芽而達(dá)到快速繁殖目的 分生組織先形成愈傷組織，后再分化實(shí)現(xiàn)細(xì)胞全能性 游離細(xì)胞或原生質(zhì)體形成胚狀體 單極分化：有根無芽或無根有芽 雙極分化：分化的芽、根分開， 形成多個分生中心， 不能移栽成活 先芽后根：易成活 先根后芽：易成活,326 植物組織培養(yǎng)基本步驟：,一、培養(yǎng)材料的采集； 二、培養(yǎng)材料的消毒； 三、制備外植體； 四、接種和培養(yǎng)； 五、根的誘導(dǎo)； 六

8、、組織苗的練苗移栽。,植物材料的采集和取材,外植體的制備,植物組織培養(yǎng)過程,試管苗,327 愈傷組織培養(yǎng)的基本過程：,一、愈傷組織的形成； 二、愈傷組織的生長； 三、愈傷組織的分化和形態(tài)的發(fā)生。,328 植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用：,一、無性快速繁殖技術(shù) 20世紀(jì)80年代，廣西、甘蔗試管苗工廠 21世紀(jì)，香蕉試管繁殖 二、獲得無病毒植株對象為病毒易染的植物 蔬菜水果：甘草、草莓、馬鈴薯 花卉：康乃馨、菊花、郁金香、水仙、百合、鳶尾 理論基礎(chǔ)：White（懷特），1943年，發(fā)現(xiàn)生長點(diǎn) 附近少病毒 三、新品種選育 四、在遺傳、生理生化和病理學(xué)研究上的應(yīng)用 理論研究,五、種質(zhì)資源的保存 煙草、胡蘿卜細(xì)胞懸

9、液低溫保存 六、人工種子 是指最外層包裹膠囊狀固定化膜的 植物胚狀體，體外模擬天然種子，防水散失、 外部沖擊、含營養(yǎng)料。 復(fù)合凝聚（+-互作） 界面聚合（成膜） 離子交換凝聚（絡(luò)合作用） 變溫凝聚（高、固，低、液）,七、植物組織器官的生物反應(yīng)器培養(yǎng) 是指那些用來生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的組織 器官（生長快，生理、生化特征穩(wěn)定）培養(yǎng)物的大規(guī) 模工廠化批量生產(chǎn)過程。 毛狀根培養(yǎng)：（霧化、流化、氣升式反應(yīng)器）生產(chǎn) 青篙素，抗瘧疾（高效、低毒）； 芽的培養(yǎng)：（氣液交替式培養(yǎng)系統(tǒng)）淺層培養(yǎng)，用 人造纖維支持，解決過深、呈玻璃化， 淺、易受剪切力影響； 體細(xì)胞胚的培養(yǎng)：（自旋過濾式反應(yīng)器）氣升式剪 切力小。,

10、329 存在問題：,一、理論問題：細(xì)胞全能性與激素作用機(jī)制； 二、技術(shù)問題：效率偏低、外植體誘導(dǎo)時間 長、培養(yǎng)基配方、繼代培養(yǎng)植株變異、 新型反應(yīng)器工藝設(shè)備改進(jìn)； 三、應(yīng)用范圍：工廠化、成本高、資金多。,33 植物細(xì)胞培養(yǎng),331 定義： 植物細(xì)胞培養(yǎng)：是指在離體條件下，將愈 傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng) 基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，得到懸浮細(xì)胞，再通 過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量細(xì) 胞群體的技術(shù)。它是在組培基礎(chǔ)上發(fā)展起 來的。,332 方法：,333 植物細(xì)胞培養(yǎng)基,A、準(zhǔn)備：滅菌與消毒,B、組成：,無機(jī)鹽類：（mol/L）硝酸鹽+少許（銨鹽+TCA鹽） 碳源：蔗糖或葡萄糖常用，果糖差

11、植物生長激素：（mg級）IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲 哚丁酸）、2、4-D、NAA（萘乙酸）、 BA、細(xì)胞分裂素、玉米素 氮源：水解酪蛋白+少許氨基酸 有機(jī)酸：TCA酸檸檬酸、蘋果酸 復(fù)合物質(zhì)：細(xì)胞生長調(diào)劑，復(fù)雜物質(zhì)如：酵母抽提液、 麥芽抽提液、椰子汁、水果汁,334 植物細(xì)胞生物器培養(yǎng),A、植物細(xì)胞特性與細(xì)胞培養(yǎng) 與微生物比較，植物細(xì)胞大； 懸浮培養(yǎng)時，植物細(xì)胞易結(jié)團(tuán)，2mm，濃度高、粘度大， 分泌粘多糖（硅油降低粘度），產(chǎn)生泡沫，需消泡； 細(xì)胞有壁，易受剪切力高的裝置損傷； 與微生物細(xì)胞相比，生長慢，周期長，分批2-3周，半連 續(xù)與連續(xù)2-3周； 與微生物細(xì)胞比較，需光、好氣，CO2/O2比要控制； 單細(xì)胞3-5天分裂，1周小細(xì)胞團(tuán)成愈傷組織，可轉(zhuǎn)移至分 化培養(yǎng)基上； 植物懸浮細(xì)胞生長與增殖可分為： 延遲、對數(shù)生長、直線生長、減緩、靜止、衰亡期；,B、植物細(xì)胞培養(yǎng)過程,335 植物細(xì)胞