1、試劑盒基礎(chǔ)知識(shí),試劑盒的概念,把某一項(xiàng)臨床生化分析測(cè)定項(xiàng)目的試劑及輔助用品配套組裝在一起，各組分在較長(zhǎng)的保存期內(nèi)穩(wěn)定使用時(shí)按試劑盒中的說(shuō)明書(shū)操作。,試劑盒所采用的測(cè)定方法特異性好、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度符合衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心、IFCC、WHO等推薦的指標(biāo)。 試劑盒的儲(chǔ)存期至少為1年。 水溶性、低粘度、無(wú)腐蝕、無(wú)毒害、不爆炸、不易燃、不污染環(huán)境。 所用標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)參考物符合衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心、IFCC、WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)和要求。,試劑盒的要求,特異性：即專一性，指分析測(cè)定中只對(duì)某一物質(zhì)起反應(yīng)，對(duì)其他物質(zhì)毫無(wú)影響或基本沒(méi)有影響。例如，GLU的HK法,靈敏度：化學(xué)反應(yīng)中能檢出的最小量,準(zhǔn)確度：測(cè)定值與

2、真值的相符合程度,常表示為真值與測(cè)定結(jié)果之差,單位與結(jié)果單位一致,或?yàn)檎嬷档陌俜直?常以“不準(zhǔn)確度”表示,目前使用標(biāo)準(zhǔn)差SD來(lái)評(píng)價(jià),精密度：同一標(biāo)本用同一方法在同樣條件下多次重復(fù)測(cè)定所得各次結(jié)果之間或各次結(jié)果與均值之間的相符合程度。精密度不能由數(shù)值表示,但以不精度方式進(jìn)行定量表示,即一組重復(fù)測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)CV來(lái)表示。,試劑盒的類型,按劑型分類 按試劑組成分類 按發(fā)展階段分類 按是否為專用包裝分類 按適用通道的不同分類,按劑型分類,干粉試劑 將各組份溶于液體中分裝再凍干，或用球磨粉碎、或混合后打成片劑，用前再加入指定量的緩沖液使其溶解（稱復(fù)溶），這種類型的試劑稱為干粉試劑。 液體試劑 優(yōu)點(diǎn)：

3、液體試劑具有組份均一、瓶間差和批間差極其微小以及使用方便（不必復(fù)溶，避免了復(fù)溶時(shí)所用蒸餾水中污染雜質(zhì)的干擾）、操作誤差小等明顯優(yōu)勢(shì)。 缺點(diǎn)：許多酶類試劑盒受溫度的影響保質(zhì)期短。 濃縮試劑 使用時(shí)只取很少的量，再加入重蒸水稀釋（例如：R-50l +重蒸水-250l）配制成工作液。,按試劑組成分類,單試劑 液體單試劑就是將某種生化檢驗(yàn)項(xiàng)目所用到的試劑科學(xué)地混合在一起，組成為一種試劑。應(yīng)用時(shí)，只須將標(biāo)本和試劑按一定比例混合，即可進(jìn)行相應(yīng)的生化反應(yīng)，然后用適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)結(jié)果。 雙試劑 液體雙試劑就是將某些生化檢測(cè)項(xiàng)目所用到的試劑，按用途科學(xué)地分成兩類，分別配成兩種試劑，通常第一試劑加入后可起到全部或部

4、分消除某些內(nèi)源性干擾的作用，第二試劑為啟動(dòng)被檢測(cè)物質(zhì)反應(yīng)的試劑，兩種試劑混合后才共同完成被檢項(xiàng)目的生化反應(yīng)。,按試劑組成分類,單試劑優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)便適用于各類生化分析儀，節(jié)約試劑位 缺點(diǎn)： 配方復(fù)雜（穩(wěn)定劑、掩蔽劑），穩(wěn)定性差，不 能完全避免內(nèi)外源物質(zhì)干擾。,按試劑組成分類,雙試劑的特點(diǎn) （1）可較徹底排除樣品空白和內(nèi)外源干擾物 （2）更加符合酶偶聯(lián)反應(yīng)的特性和過(guò)程 （3）試劑配方簡(jiǎn)單 （4）試劑穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存，運(yùn)輸和使用 （5）可用抑制法直接測(cè)定某些同工酶,液體雙試劑的優(yōu)點(diǎn),提高了抗干擾反應(yīng)的能力 在臨床生化測(cè)定過(guò)程中，血標(biāo)本除了含有待測(cè)物質(zhì)外，還含有各種酶、有機(jī)物、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)，這

5、些物質(zhì)都會(huì)干擾或參與測(cè)試反應(yīng)，引起非特異性反應(yīng)干擾，而雙試劑型試劑盒設(shè)計(jì)的一個(gè)主要目的就是為了克服這種干擾反應(yīng)。 排除樣品中非測(cè)定成分的干擾，提高準(zhǔn)確性 例如：ALT 內(nèi)源性丙酮酸+NADH LDH 乳酸+NAD L-丙氨酸+-酮戊二酸+NADH ALT 丙酮酸+L-谷氨酸 丙酮酸+NADH+H+ LDH 乳酸+NAD+H2O,增強(qiáng)了工作試劑的穩(wěn)定性： 試劑組分高度均一：不必凍干復(fù)溶，避免了干粉試劑復(fù)溶時(shí)所用蒸餾水污染雜質(zhì)的干擾作用。避免了干粉試劑盒分裝，凍干，復(fù)溶過(guò)程中引起的瓶間差，提高了測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度.,液體雙試劑的優(yōu)點(diǎn),按發(fā)展階段分類,傳統(tǒng)試劑盒 新型試劑 快速反應(yīng)試劑盒 一步法試

6、劑盒 多項(xiàng)同測(cè)組合試劑盒 卡式試劑盒 濃縮試劑盒,按是否為專用包裝分類,專用包裝試劑：7060、7170、貝克曼包裝等 非專用包裝試劑,按適用通道的不同分類,封閉通道：如條碼試劑。 開(kāi)放通道,試劑盒性能評(píng)價(jià),實(shí)用性 可靠性,實(shí)用性,標(biāo)本類型 操作要求 服務(wù)要求：電力供應(yīng)，通風(fēng)環(huán)境，試劑處理等 消耗品要求 技術(shù)職能要求 成本 分析速度 一般問(wèn)題 如臨床應(yīng)用價(jià)值、試劑的效期、包裝規(guī)格是否多樣、操作是否簡(jiǎn)便等。,可靠性（試劑盒基本性能指標(biāo)）,準(zhǔn)確度：測(cè)定值與真值的相符合程度 精密度：同一標(biāo)本用同一方法在同樣條件下多次重復(fù)測(cè)定所得各次結(jié)果之間或各次結(jié)果與均值之間的相符合程度。 線性范圍（分析范圍） 干

7、擾性 靈敏度：化學(xué)反應(yīng)中能檢出的最小量 穩(wěn)定性 特異性 方法學(xué)性能（IFCC，酶法 ，HDL，LDL方法等）,重點(diǎn)選擇的幾個(gè)指標(biāo),準(zhǔn)確度 通常以回收率、定值血清的靶值范圍、對(duì)照試驗(yàn)及干擾試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)分析判斷。 精密度 試劑的瓶間差異、批內(nèi)精密度和批間差異三組測(cè)定的平均值之間應(yīng)無(wú)顯著差異，否則，試劑盒的均一性不符合要求。 線性范圍 指該試劑盒按其說(shuō)明使用時(shí)可準(zhǔn)確測(cè)量的范圍。 抗干擾作用 雙試劑型試劑盒主要優(yōu)點(diǎn)是抗干擾作用。,靈敏度 采用蒸餾水（5%牛血清白蛋白溶液）作為 空白樣本，空白樣本應(yīng)不含被測(cè)物。在生化分析儀上連續(xù)檢測(cè)20次，記錄檢測(cè)結(jié)果。計(jì)算20次結(jié)果的均值與標(biāo)準(zhǔn)差SD。以空白均值加兩倍

8、標(biāo)準(zhǔn)差作為報(bào)告方法的檢測(cè)限。 穩(wěn)定性 試劑盒穩(wěn)定性是指試劑盒在規(guī)定條件下儲(chǔ)存仍保持其性能指標(biāo)的期限。該期限應(yīng)符合規(guī)定的儲(chǔ)存期。方法有以下三種。 1原包裝試劑的穩(wěn)定性 2復(fù)溶后試劑的穩(wěn)定性 3不同溫度下的保存期,重點(diǎn)選擇的幾個(gè)指標(biāo),化學(xué)試劑盒常用的反應(yīng)原理,比色法 由單純的化學(xué)物質(zhì)參與反應(yīng)，呈色，在一定波長(zhǎng)下比色。例如總蛋白的雙縮脲比色法、白蛋白的溴鉀酚綠法。 酶法 由特異性的酶來(lái)催化反應(yīng)，在一定波長(zhǎng)下比色。例如甘油三酯由甘油激酶和過(guò)氧化物酶來(lái)催化反應(yīng)；尿素有脲酶來(lái)催化反應(yīng)進(jìn)行。 免疫比濁法 抗體（Ab）與可溶性抗原（Ag）反應(yīng)，形成一定結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物，成為懸浮于反應(yīng)溶液中的微粒。這種在沉淀反

9、應(yīng)中形成的微粒具有特殊的光學(xué)性質(zhì)。,常用監(jiān)測(cè)物質(zhì)的特性,1NADH輔酶I或NADPH輔酶II： 乳酸脫氫酶（LDH） NAD+或NADP+ （alt） 蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH） NAD+或NADP+ （co2） 谷氨酸脫氫酶（GLDH） NAD+或NADP+ （hcy）,常用監(jiān)測(cè)物質(zhì)的特性,NADH或NADPH在340nm有特征性光吸收，而它們的氧化型NAD+或NADP+則沒(méi)有這個(gè)吸收峰，340nm波長(zhǎng)處的吸光度與NAD（P）H的濃度成正比。,常用監(jiān)測(cè)物質(zhì)的特性,例一：肌酸激酶（CK） 磷酸肌酸ADP CK 肌酸ATP 葡萄糖ATP HK 葡萄糖-6-磷酸ADP 葡萄糖-6-磷酸NADP G6P

10、DH 6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+ 例二：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT） 丙氨酸-酮戊二酸 ALT 丙酮酸谷氨酸 丙酮酸NADHH+ LDH 乳酸NAD+H2O,常用監(jiān)測(cè)物質(zhì)的特性,2H2O2指示反應(yīng) 葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化酶、膽固醇氧化酶：用于葡萄糖、尿酸、甘油、膽固醇的測(cè)定，可使相應(yīng)底物被O2氧化成H2O2，H2O2可通過(guò)一系列指示反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。,常用監(jiān)測(cè)物質(zhì)的特性,使單一的色素原顯色。無(wú)色色素原過(guò)氧化物酶（POD）存在下被H2O2氧化后可生成有色的色素。 使成對(duì)的色素原顯色。必須要兩個(gè)色素原共同存在，再在指示酶POD的催化下生成色素。 發(fā)光反應(yīng)。H2O2也可用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來(lái)監(jiān)測(cè)，它是

11、憑借某些熒光前身物在氧化后，處于激發(fā)狀態(tài)的分子可發(fā)射光子，光子量和H2O2的濃度成正比。,常用監(jiān)測(cè)物質(zhì)的特性,例一：葡萄糖（GLU） 葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸H2O2 H2O2苯酚4-氨基安替比林 過(guò)氧化物酶 醌亞胺H2O 例二：甘油三酯（TG） 甘油三酯H2O 脂蛋白脂酶 甘油脂肪酸 甘油ATP 甘油激酶 -磷酸甘油ADP -磷酸甘油O2 甘油磷酸氧化酶 磷酸二羥丙酮H2O2 H2O2 +4-氨基安替比林+ESPAS 過(guò)氧化物酶 醌亞胺H2O ESPAS:N-乙基-N-(3-磺丙基)-間-茴香胺,常用監(jiān)測(cè)物質(zhì)的特性,3硝基苯衍生物 芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：對(duì)-硝基酚和有

12、機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸形成的酯類 糖苷酶：對(duì)硝基酚和糖苷衍生物 -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：對(duì)-硝基苯胺的氨基酰衍生物,常用監(jiān)測(cè)物質(zhì)的特性,例一：堿性磷酸酶（ALP） 磷酸對(duì)硝基苯H2O ALP 磷酸鹽對(duì)硝基苯酚 例一： -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（ -GT） -谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺 雙甘肽 -GT 谷氨酰基雙甘肽5-氨基-2-硝基安息香酸,試劑盒測(cè)定基本方法,四個(gè)區(qū)域 三大方法,試劑盒測(cè)定基本方法,四大區(qū)域 實(shí)時(shí)反應(yīng)曲線：Real time reaction curve,試劑盒測(cè)定基本方法,四個(gè)區(qū)域 延遲區(qū)：delay time,lag time； 等速區(qū)：斜率相等的線性段； 過(guò)渡區(qū)：兩點(diǎn)固定

13、時(shí)間法，可在此段開(kāi)窗； 平衡區(qū)：終點(diǎn)法在此區(qū)內(nèi)開(kāi)窗；,試劑盒測(cè)定基本方法,三大方法 速率法（Rate）：亦稱動(dòng)力學(xué)法，連續(xù)監(jiān)測(cè)法； 固定時(shí)間法（Fixed time）：亦稱兩點(diǎn)法； 終點(diǎn)法（End Point）：一點(diǎn)終點(diǎn)法、兩點(diǎn)終點(diǎn)法（日立系統(tǒng)）；Olympus 只有終點(diǎn)法；Beckman 的終點(diǎn)法1（不減試劑空白）終點(diǎn)法2（減去試劑空白）,試劑盒測(cè)定基本方法,速率法（Rate）： 測(cè)光點(diǎn)一般設(shè)置在加入啟動(dòng)因子并孵育一段時(shí)間后開(kāi)始，持續(xù)1-3min。 一般應(yīng)用于酶類項(xiàng)目。 可以使用因數(shù)法來(lái)計(jì)算待測(cè)濃度。,固定時(shí)間法 測(cè)光點(diǎn)設(shè)置在加入啟動(dòng)因子后，分前后兩點(diǎn)。 多用于免疫比濁法類項(xiàng)目 終點(diǎn)法（En

14、d Point）： 按照測(cè)光點(diǎn)的個(gè)數(shù)分為：一點(diǎn)終點(diǎn)法、兩點(diǎn)終點(diǎn)法。 兩點(diǎn)終點(diǎn)法的測(cè)光點(diǎn)一般分別設(shè)置在加入啟動(dòng)因子前后。 多數(shù)基質(zhì)類項(xiàng)目都采用這種方法。,試劑盒測(cè)定基本方法,試劑盒說(shuō)明書(shū),一看反應(yīng)原理，確定測(cè)定方法、反應(yīng)方向、檢測(cè)波長(zhǎng) 二看操作程序，確定試劑量、樣本量、反應(yīng)量 三看標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控的使用方式及貨號(hào) 四看標(biāo)本的要求，使用血清、血漿還是尿液及注意事項(xiàng) 五看試劑/工作試劑的穩(wěn)定性 六看靈敏度、抗干擾性、線性范圍等技術(shù)指標(biāo)，觀察與其它試劑比較的優(yōu)缺點(diǎn),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控品,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)又稱參考物質(zhì)，是一類充分均勻，并具有一個(gè)(或多個(gè))確定的特性值的材料和物質(zhì)。 作用：它用以校準(zhǔn)儀器設(shè)備、評(píng)價(jià)測(cè)量方法，

15、或給其它物質(zhì)賦值。 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果一般表示為：標(biāo)準(zhǔn)值總不確定度。,理解標(biāo)準(zhǔn)品和校準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品的定值由稱量和容積計(jì)算確定。檢定不合格即報(bào)廢，決不可將實(shí)測(cè)值替代修正。,校準(zhǔn)品 為了克服因純標(biāo)準(zhǔn)液和患者樣品間的基體差異，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)重誤差，20年前開(kāi)始引用具有與患者樣品基體相似的校準(zhǔn)品替代標(biāo)準(zhǔn)品，用于日常工作?？墒?，盡管校準(zhǔn)品的主要來(lái)源是人的血清，為了使校準(zhǔn)品內(nèi)的一些分析物水平達(dá)到某個(gè)程度，而且形成穩(wěn)定的產(chǎn)品，所有的校準(zhǔn)品、控制品、室間調(diào)查品等都是處理過(guò)的血清。和原來(lái)的天然血清間又產(chǎn)生了新的基體差異。,理解標(biāo)準(zhǔn)品和校準(zhǔn)品,校準(zhǔn)品的特點(diǎn) 校準(zhǔn)值隨方法而異 校準(zhǔn)品中被檢分析物的含量無(wú)法由稱量法和容量法確 定，只能倚賴于分析方法。校準(zhǔn)品的校準(zhǔn)值必須取決于分析方法或檢測(cè)系列。 新鮮患者標(biāo)本是最佳校準(zhǔn)品 須明確的，所有用于檢驗(yàn)中的檢測(cè)方法、儀器、試劑等都是用來(lái)檢測(cè)患者新鮮標(biāo)本的，不是用來(lái)檢測(cè)校準(zhǔn)品這樣的處理過(guò)樣品。,理解標(biāo)準(zhǔn)品和校準(zhǔn)品,質(zhì)控品,IFCC的定是專門用于質(zhì)量控制目的的標(biāo)本或溶液，不用于校準(zhǔn)，對(duì)穩(wěn)定性、瓶間差要求高。分定值和不定值兩種。 質(zhì)控品選擇： 應(yīng)該選擇有幾個(gè)濃度的、濃度范圍分布較寬的、最好是醫(yī)學(xué)決定水平的、有可報(bào)告范圍范圍是上下限值的質(zhì)控品。 人血清基質(zhì)，以減少基質(zhì)效應(yīng)；無(wú)傳染性；成分分布均勻，瓶間差??；液態(tài)及凍干品復(fù)溶后穩(wěn)定