1、,干細胞產(chǎn)品技術(shù)服務,OricellTM,OricellTM,最新產(chǎn)品：,1. ES成神經(jīng)元分化試劑盒； 2. ES成心肌分化試劑盒；,3. ES成肝實質(zhì)細胞分化試劑盒； 4. MSC成肝實質(zhì)細胞分化試劑盒； 5. NSC成神經(jīng)元分化試劑盒；,6. NSC成星型膠質(zhì)細胞分化試劑盒；,目錄：,胚胎干細胞培養(yǎng)和技術(shù)介紹,成體干細胞的常見問題與解決方案,1.細胞和培養(yǎng)（干細胞、原代細胞產(chǎn)品和試劑） 2.細胞分化（多個方向的標準方法） 3.細胞示蹤（GFP/RFP 和定制方法）,干細胞凍存和復蘇方案 干細胞應用技術(shù),Stem cell,間充質(zhì)干細胞（MSC）,Mesenchymal Stem Cell

2、s是一種多能干細,胞；,胚胎干細胞（ES）,Embryonic Stem Cells是一種全能的干細,胞,神經(jīng)干細胞（NSC）,Neural Stem cell是一種神經(jīng)系統(tǒng)的多能干,細胞,Primary cell,神經(jīng)元系統(tǒng)（多個來源和物種，海馬、皮層） 星型膠質(zhì)細胞（多個物種皮層） 肝實質(zhì)細胞；,肝臟前體細胞；,分離其他客戶定制細胞；,胚胎干細胞,胚胎干細胞,胚胎干細胞(embryonicstemcellES, 細胞) 是指胚泡期的內(nèi)細胞團中分離出的尚未分化的、 能在體外培養(yǎng)、具有發(fā)育全能性的早期胚胎細胞 無限增殖、自我更新,可分化為三個胚層來源的各種組織及細胞類型,ES細胞的來源：5d

3、胚胎,AB C D,ES生長特性,鼠：生長快，胰酶消化，2天傳一次，可一傳多。,復蘇率較高。,人：生長慢，機械分離，710天傳一次，相,對較少。1:41:6。,復蘇率低。,表面抗原的表達,Oct-4：一種轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)育全能性的標志。,堿性磷酸酶（AKP）：常被用來作為鑒定ES,細胞及其分化與否的重要標志。,SSEA-1：小鼠ES表達,SSEA-3、SSEA-4：人ES表達,染色體結(jié)構(gòu),核型分析：正常穩(wěn)定的二倍體核型。 不隨傳代次數(shù)而改變。,46，XX；46，XY,核型檢測：46，XX,多能性和全能性 體內(nèi)：畸胎瘤實驗 特定抗,擬胚體,特定條件誘 體免疫 導/自然分化 組化,體外分化,去除飼養(yǎng)層

4、細胞,全能性,體內(nèi)：畸胎瘤實驗,體外：去除飼養(yǎng)層細胞,擬胚體（EB, embryoid body。為ES 細胞懸浮,生長自發(fā)分化形成,含有內(nèi)中外三個胚層組織,能基 本上模擬體內(nèi)的發(fā)育過程) ； 貼壁誘導；,特定條件誘導/自然分化（除去LIF） 各胚層特定抗體免疫組化檢測,體內(nèi)：畸胎瘤檢測,血管組織 呼吸道上皮,鱗狀上皮,腺體組織 脂肪組織,體內(nèi)分化,外胚層：鱗狀上皮、神經(jīng)組織等,中胚層：骨和軟骨、橫紋肌、骨骼肌、血細胞和骨髓細胞等 內(nèi)胚層：柱狀上皮、腸管樣組織等,體外：分化形態(tài),ES 貼壁誘導,EB 約57天后出現(xiàn)自主性搏動,129 Mouse,Human ES,免疫組化檢測,Nestin (

5、ectoderm ) Troponin (mesoderm ),Tubulin (ectoderm ) AFP (endoderm),神經(jīng)分化：貼壁誘導第2天,神經(jīng)分化：貼壁誘導第5天,IHC3Tublin,特異性抗原的表達情況,抗原 人ES 鼠ES,Oct-4 + +,Nanog + +,SSEA-1 +,SSEA-3 + ,SSEA-4 + ,不斷有新的蛋白標記被發(fā)現(xiàn)和論證,堿性磷酸酶染色,小鼠ES流式圖,染色體結(jié)構(gòu),核型分析：正常穩(wěn)定的二倍體核型。 不隨傳代次數(shù)而改變。,人（46，XX），鼠（40，XY),性別分析,性別通過PCR的方法鑒定，目的基因是基因組,DNA的Y染色體相關(guān)基因Ts

6、py，陽性對照用X,染色體相關(guān)基因PolA1以及Gapdh 。,ES Clone,mES-GFP,Human ES-GFP,MEF 細胞：ES成功的一個重要因素,Cyagen提供的MEF經(jīng)過-irradiation 處理，,確保所有的細胞都完全失去增殖能力，又可以保 證最佳支持和分泌能力，同時沒有任何化學有毒 物質(zhì)的污染，為你ES細胞提供最佳的生長環(huán)境； 為ES的增殖提供多種因子；,實驗室的調(diào)查普遍結(jié)果：,據(jù)Cyagen 對多個實驗室使用的53個ES細胞,的樣品進行檢測，45%被支原體污染；,沒有嚴格質(zhì)量控制和環(huán)境控制的情況下制作的,MEF：有35%以上是攜帶支原體，這個數(shù)據(jù),還根據(jù)操作技術(shù)不

7、成熟，使用動物污染嚴重情況， 風險也會大大的增加；,絲裂霉素C（MITOMYCINC）：,A、長期接觸絲裂霉素C，藥物毒性將嚴重影響操作人 員的身體健康；（單位量1030ug/ml處理20個10cmdish 需要36mg）,B、絲裂霉素C溶液的不穩(wěn)定，4保存，也會快速降解， 導致處理的細胞不能完全失活，這將嚴重影響后面實驗 分析；,C、絲裂霉素C的殘留，微量的絲裂霉素C也會造成ES細 胞增殖抑制和分化；（因為其是細胞內(nèi)DNA結(jié)合劑）,OCT-4 (+) SSEA-1 (-) SSEA-4 (+),A A A,B B B,C C C,Es細胞培養(yǎng)的過程：,如何準備狀態(tài)良好的MEF細胞； 消化傳代

8、過程；,如何去除MEF細胞； 挑克隆的操作；,如何準備用于進行各種基因操作的細胞； 如何準備用于進行注射的細胞；,如何準備狀態(tài)良好的MEF細胞；,取胚胎（13.5d）：去除頭部和四肢；,剪碎后加入0.125%胰酶進行消化到組織塊基 本消失；,終止消化并離心收集細胞；（檢測細胞支原體） 重懸接種：5000-10000cells/cm2 第二天換液后培養(yǎng)3天，進行-射線照射； 凍存檢測；,生產(chǎn)過程控制：,動物：胚胎的孕齡； 動物的污染物； 細胞的支原體；,細胞的支持能力； 細胞的失活；,蛋白表達檢測；,合適的MEF的密度：,細胞的貼壁效率； 細胞的分泌能力； 細胞的大?。?最佳的密度受到很多因素影

9、響：25000cells,過密：克隆生長緩慢，克隆小，但是立體感好； 過?。嚎寺∪菀追只?，邊緣不清晰，但是克隆增 殖稍快；,最佳的密度：克隆邊緣清晰，細胞容易增殖，大 小均一。,如何去除MEF：,無飼養(yǎng)層培養(yǎng)：但是代數(shù)非常有限，基本不能長 期傳代；,MEF培養(yǎng)：可以長期培養(yǎng)，細胞的狀態(tài)好，不,影響細胞的全能性；,原理：利用不同細胞的貼壁的時間差異；,步驟：消化后離心重懸，在包被明膠的皿上貼壁,30min，輕輕吸出上清，接入另外一個包被有,明膠的皿中30min，再吸出上清中的細胞；并 在包被的皿上培養(yǎng)一段時間，就可以去除大部分 的MEF細胞；,影響因素：,克隆的狀態(tài)：分化的細胞的貼壁性會大大增加

10、；,MEF的狀態(tài)：MEF如果有大量的碎片也會增加,液體的粘稠度干擾細胞的正常分離；,消化的效果：如果有MEF沒有和ES很好的分開 ，會將ES一起貼在皿上；,細胞團和顆粒：顆粒大細胞團會導致細胞快速沉 淀并導致細胞貼壁；,如果效果不佳可以進行多次的重復，但是會大大 減少細胞的回收率；,ES細胞的傳代：,細胞的克隆出現(xiàn)足夠大，細胞的邊緣開始出現(xiàn)不 清晰，細胞的克隆出現(xiàn)部分分化的情況；一般的 周期是3-5天；,傳代比例依據(jù)細胞的克隆大小和細胞的生長狀態(tài) ，比例為1：5-1：10；,消化的時候觀察一般以MEF為標準，如果MEF 基本上已經(jīng)開始脫壁就可以終止消化；,挑克隆技術(shù)：,當克隆大部分出現(xiàn)分化的時

11、候； 克隆大小不均并且生長緩慢； 注意事項：,拉針（要注意末端的大?。┗蚴褂?ml的注射 器；,在體視鏡下操作，要在解剖超凈臺中操作； 注意環(huán)境，避免污染；,提取的克隆要消化后才能進行接種； 單克隆的培養(yǎng)周期長，要更有耐心；,用于ES囊胚注射的細胞控制：,低代數(shù)：（細胞的全能型和基因變異和染色體變 異）,低分化程度：（細胞分化會大大影響細胞最后的 整合的效率和生殖遺傳的比例）,最低的控制標準：正常的核型，細胞的各種分化 蛋白沒有表達，各種ES的正常表達蛋白正常； 具有成瘤性；增殖速度快；無任何外源污染；,其他類型的成體干細胞,間充質(zhì)干細胞 神經(jīng)干細胞,間質(zhì)干細胞是目前研究最多的干細胞,來源研究

12、方向：不斷有文章報道從不同的組織分 離出MSC，整體方向是有利臨床廣泛取材和減 少病人痛苦；,與組織工程結(jié)合的研究方式，最重要是如何提 高與組織的相容性和提高在向多個方向分化的控 制，如何成為一個真正的組織；,臨床治療研究，也是目前細胞治療的研究熱點， 國內(nèi)主要的治療細胞；,基因研究的載體，干細胞分化機制模型；,Cyagen能夠提供協(xié)助：,來源研究：基本上從體內(nèi)的各個組織中發(fā)現(xiàn)非常 多的干細胞，包括肌肉，肺部，肌腱，血管，皮 膚等，而這些細胞都具有含量非常少，同時也具 有非常明顯的組織特意性，表達非常多的組織特 異性的蛋白；（提供高難度提取服務）,組織材料學：結(jié)合納米材料和其他生物學材料， 用

13、于研究具有臨床前景的材料；（細胞相容性， 蛋白表達，細胞分化分析等）,臨床研究：如何從單一來源獲得大量穩(wěn)定而且維 持良好的生物學特性的細胞，同時保證生物的安 全性；（提高全套的技術(shù)支持和服務）,間質(zhì)干細胞,定義：來源于中胚層的早期細胞， 能夠分化為 多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的細胞。,來源組織：骨髓、骨膜、脂肪組織、臍血等。 來源物種：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、 豬等。,分離方法,骨髓,人，猴子，犬,密度梯度離心法：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差 時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度 沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。,大鼠，小鼠，兔子：全骨髓貼壁法,脂肪等組織：,人、大鼠、小

14、鼠： 酶消化法,鑒定方法 不同物種的表面標記差異：,表面標志 人 ,猴子 大鼠 小鼠,陽性 CD29,CD44,CD71,C D90 CD29,CD44,CD105 CD29,CD44 ， CD166,陰性 CD34,CD45,CD105,C D166 CD34,CD45 弱陽:CD34，CD45,傳代能力,有限增殖，隨著傳代次數(shù)增加，分化能力逐漸降 低，按照1：2的比例：,人：12代達到純化，最多1520代。,大鼠：34代達到純化，最多2025代。,小鼠：78代達到純化，最多2530代。,間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的問題/解決方案, BMSCs：來源長骨的骨髓，體內(nèi)與造血功能有緊密關(guān)系，,但是也存在牙

15、髓和其他短骨里面，缺點是取材時給病人 的痛苦較多；, ADSCs：來源全身的脂肪組織，包括皮下和內(nèi)臟脂肪墊；,來源屬于微創(chuàng)方法取材，主要是來源于抽脂減肥的手術(shù)；, 其他來源的間質(zhì)干細胞：胰腺干細胞、心臟干細胞、肝 臟干細胞、肌腱干細胞和牙周膜干細胞等；還有新生兒 的臍帶、胎盤等其他組織；, 細胞形態(tài)：不同的組織來源的間質(zhì)干細胞的形態(tài)多樣，,基本無法從細胞的形態(tài)上進行有效的區(qū)分；, 表面抗原：不同來源的細胞的表面標記會有差異BMSC 和ADSCs的區(qū)別就是CD106（+/-）和CD49d（-,/+）；, 分化能力：會有較大的波動，隨著不同個體、不同組織,來源會有變化；, 培養(yǎng)液選擇：不同來源也是

16、不同！,間質(zhì)干細胞形態(tài)特征,P0,40X,P3,40X,骨髓間質(zhì)干細胞定向分化為脂肪細胞,梭形、纖維樣細胞 原代：克隆樣生長 傳代后：勻質(zhì)、渦旋狀排列,Human Dog,Rat Monkey,Mouse Rabbit,間質(zhì)干細胞培養(yǎng)系統(tǒng),標準：,1.增殖速度變化； 2.細胞分化影響； 3.形態(tài)學變化；,4.克隆形成率變化； 5.基因表達影響；,6.使用的特殊要求； 7.價格因素；,如何選擇間質(zhì)干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)？, 基礎培養(yǎng)基的選擇:依據(jù)細胞的生長和要求參照文,章進行優(yōu)化，需要添加部分的氨基酸或者糖；, 血清篩選：應該利用10株以上的細胞，進行克隆,形成率、生長曲線、分化能力的比較；, 添加物：

17、營養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)、抗生素、細胞,因子添加；,優(yōu)選 專業(yè) 血清,普通 胎牛 血清,普通 牛血,清,細胞培養(yǎng)過程常見問題,細胞增殖速度下降：間質(zhì)干細胞不是無限的細胞 系，最佳的實驗窗口是P3-P8；,細胞老化：培養(yǎng)環(huán)境不適合（包括培養(yǎng)的表面和 培養(yǎng)液）；胰酶對細胞表面蛋白的傷害；缺乏相 關(guān)的生長因子；細胞本身端粒影響；,細胞分化：血清中激素影響、培養(yǎng)表面影響、體 外培養(yǎng)時間影響；,間質(zhì)干細胞常見的污染和控制,細胞污染、造血系統(tǒng)細胞；,取材來源污染：病毒、或者其他感染；,支原體污染：隱性污染，一般難以察覺，導致細胞 狀態(tài)不斷下降，影響細胞正常增殖，擴散和污染環(huán) 境，影響最大；,神經(jīng)干細胞,廣泛存

18、在于成年或胚胎哺乳動物大腦內(nèi),可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞。,神經(jīng)干細胞,神經(jīng)干細胞生物學特性,Nestin陽性,自動聚集成球，球體的表面存在絨毛 懸浮生長,無血清培養(yǎng)，血清替代物，bFGF，EGF,神經(jīng)干細胞,NSC存在神經(jīng)系統(tǒng)中的干細胞,分化：神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞等,NSC取材和培養(yǎng),鼠神經(jīng)干細胞（NSC）：來源于14.5d胚胎的大腦GE區(qū)；,大鼠神經(jīng)干細胞-懸浮培養(yǎng) 小鼠神經(jīng)干細胞-貼壁培養(yǎng),大鼠神經(jīng)干細胞-貼壁培養(yǎng) 小鼠神經(jīng)干細胞-貼壁培養(yǎng),使用Cyagen 神 經(jīng)干分化試劑,使用血清誘導,NSC的操作要點：,傳代培養(yǎng)：,1、懸浮培養(yǎng)必須控制球的大小，傳代時

19、,自然沉降，去除其中大球；可以使用機械 的方法；,2、懸浮法培養(yǎng)可以獲得大量的細胞；,3、貼壁法培養(yǎng)細胞可以用于轉(zhuǎn)基因操作，,但是費用很高；,4、整個培養(yǎng)過程必須保證無血清； 5、保證細胞純度，獲得高擴增率；,干細胞的分化機理和相關(guān)的技術(shù)產(chǎn)品,干細胞分化機理,Wildtype,mouse,fibroblasts,Mouse,Fibroblasts,Carrying,Myf5 BAC,干細胞分化能力鑒定,分化試劑（檢測干細胞的尺）：必須穩(wěn)定，否則結(jié),果波動非常大，將無法分析；,每次配置的分化試劑：必須是有陽性對照進行檢 測，保證有分化誘導能力再用于檢測其他的細胞； 不同的物種間最佳的誘導物濃度不

20、同，所以不同 物種間最好做一下濃度上面的優(yōu)化；,干細胞分化的常見問題,分化比例影響因素；, 細胞群分化能力：整個細胞群體中干細胞的比率決定； 代數(shù)：細胞的分化比率隨代數(shù)增加下降；, 誘導系統(tǒng)穩(wěn)定性：誘導組方、藥物效價和配置過程影響；,分化時間影響因素,成骨：2-4周 成脂：2-4周,成軟骨：3-4周,不同物種：人和大鼠容易誘導，小鼠的需要更長 時間，狗和兔子誘導時間波動大；,動物大小影響：人和靈長類、狗等胚胎期或者新 生代幼體分化率偏低；而成體的來源的MSC分 化能力高！,臍帶、臍血的MSC分化比例較低。,細胞質(zhì)量影響才是影響分化關(guān)鍵的核心！,分化的影響因素,不同的物種：波動很大，不能橫向比較

21、；,不同提取方法：操作方法的差異，導致細胞群組 成差異；,不同的培養(yǎng)系統(tǒng)：影響細胞的形態(tài)、大小、克隆 的形態(tài)也不同，分化能力也有差異；使用a-,MEM會降低干細胞的成脂肪分化；,不同代數(shù)：分化也是會有波動，同時各個方向的 分化變化的速度不同步；,Cyagen提供完善的分化系統(tǒng),骨、脂肪、軟骨分化：囊括了多個物種、多種來 源的干細胞的分化的試劑； 穩(wěn)定高效：干細胞的金指標； 心肌分化、神經(jīng)分化,OricellTM提供定制的分化服務；,干細胞大規(guī)模培養(yǎng)解決方案,應用的方向；, 大動物的體內(nèi)實驗：包括靈長類 等，需要的細胞量都是,108這個數(shù)量級以上；, 多組動物的實驗：要獲得更加有說服力結(jié)果； 大

22、規(guī)模的篩選：中藥成分篩選、藥物單體實驗； 臨床使用干細胞：干細胞的最終應用；,OricellTM 提供大規(guī)模細胞培養(yǎng)服務,OricellTM大規(guī)模培養(yǎng)的實現(xiàn),使用T175培養(yǎng)：數(shù)量上可以直接增加，但是增加污染的風險，系 統(tǒng)不穩(wěn)定；,使用多層培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶；,使用小型細胞培養(yǎng)罐：細胞擴增容易但是收獲困難，條件控制不成,熟；,密閉的細胞工廠系統(tǒng)：全密閉系統(tǒng)，可以用增加 數(shù)量方法放大規(guī)模，但是成本較高，需要環(huán)境控 制系統(tǒng)；,干細胞質(zhì)量控制和解決方案；,表面標記與細胞分化：,表面標記有哪些核心標記：現(xiàn)在目前并未有一個 非常特異得到公認的表面抗原分子；,Cyagen研究發(fā)現(xiàn)，表面抗原分子和分化不具有,穩(wěn)定

23、相關(guān)性；,表面抗原變化主要集中在前期和高代數(shù)時變化； 分化能力的變化主要和代數(shù)有關(guān)，和表面標記有 半相關(guān)性；,干細胞增殖能力指標；, 生長曲線：表現(xiàn)細胞自我更新能力的一個指標； 克隆形成率：表示具有較強自我更新能力的細胞,的比例的指標；,屬于和干細胞“Self-Renew”相關(guān)；,體內(nèi)實驗使用細胞污染物控制,細胞污染物的控制和檢測方法；,細胞間污染：不能不同細胞一起操作，使用相同的一瓶 試劑；操作最好間隔1個小時；,細菌污染：所有使用的培養(yǎng)試劑進行無菌檢測；,真菌污染：嚴重影響細胞體內(nèi)試驗，一旦出現(xiàn)極難處理； 內(nèi)毒素：對所有使用的器械、容器、管道都進行處理，,250度干烤或者是用堿洗；,外源異

24、物污染：避免使用玻璃操作，使用有認證的產(chǎn)品， 個人防護；同時使用前對細胞懸液中進行觀察，看是否 有顆粒；,大規(guī)模和有穩(wěn)定質(zhì)量控制的細胞的應用,動物的體內(nèi)試驗和解決方案,干細胞的動物體內(nèi)實驗,干細胞體內(nèi)應用的注意事項,凍存的細胞是否可以復蘇直接用于實驗； 理論上是可行，但是對凍存液要求很高； 復蘇率達到90%以上，減低死亡細胞影響；,MSC類的細胞普通凍存液復蘇后細胞非常的脆,弱，最好經(jīng)過一次的培養(yǎng)；,需要清洗：去血清和DMSO（2.5-11g/kg）， 同時降低內(nèi)毒素；,Oricell TM NCR凍存液、DMSO-Free凍存液,細胞自然成團對體內(nèi)實驗的影響,導致血管內(nèi)出現(xiàn)細胞栓塞，直接導致

25、動物急性死 亡；,會在肺部、肝積聚，減低器臟功能，長期會有纖 維化風險；,細胞在懸浮的狀態(tài)下，會自然的聚集成松散團； 死細胞多，釋放的DNA會導致細胞聚成大團；,1. 一小時內(nèi)使用：,2. 細胞充分吹勻或者使用濾網(wǎng)：200-250目 3. 培養(yǎng)過程中細胞絕對不能過密：80%最佳 4. 細胞代數(shù)不能太高P5,體內(nèi)試驗的實現(xiàn)方法：,注射的方法和溶劑；,局部注射：肌肉、肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)； 全身注射：鼠尾靜脈、兔子耳緣靜脈等； 溶劑：培養(yǎng)液、PBS、HBSS、生理鹽水； 污染物的控制；（內(nèi)毒素、熱源、真菌污染、外 源物質(zhì)污染的影響）,體內(nèi)研究：示蹤作用,GFP/RFP干細胞研究中重要作用,干細胞移植

26、后在體內(nèi)的生物學變化（如遷移、分 布、增殖、分化等）都離不開對植入干細胞的示 蹤和定量技術(shù)。,GFP或RFP由于檢測方便、表達穩(wěn)定和不影響細,胞功能等特點，目前在干細胞的移植研究中GFP 或RFP的重要性越來越得到重視。,GFP、RFP標記,綠色熒光蛋白（GFP） 紅色熒光蛋白（RFP）,擬人化綠色熒光蛋白（hrGFP）,GFP、RFP標記的優(yōu)點,檢測方便：不需要底物或輔因子,可對活體檢測, 因而可對被標記對象進行動態(tài)、連續(xù)的觀察。 熒光穩(wěn)定，不易淬滅，尤其是hrGFP 對細胞的毒性較小,GFP標記的人胚胎干細胞,GFP/RFP標記的小鼠胚胎干細胞,GFP標記的間質(zhì)干細胞,成人間質(zhì)干細胞,胎兒

27、間質(zhì)干細胞 食蟹猴間質(zhì)干細胞,F344大鼠間質(zhì)干細胞,SD大鼠間質(zhì)干細胞,Wistar大鼠間質(zhì)干細胞,神經(jīng)干細胞,人神經(jīng)干細胞,小鼠神經(jīng)干細胞,GFP標記的小鼠神經(jīng)干細胞,干細胞應用研究,賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司,干細胞研究為什么引起這么大的重視,肌萎縮側(cè)索硬化病 (ALS),Alzheimers Disease,造血干細胞移植,我國白血病的年發(fā)病率為4/10萬人，每年新增 約4萬名白血病患者, 其中約2萬名是兒童。 我國長江流域以南的兩廣和云貴地區(qū)的地中海貧 血的發(fā)病率高達10%以上,廣東省每年新增重度,beta-地貧患兒400名。,一些重度自身免疫性疾病,如紅斑狼瘡,多器官硬 化等發(fā)病

28、率更高。,造血干細胞移植存在的問題,移植后造血恢復緩慢,移植物抗宿主病(graft-versus-host,disease, GVHD)是骨髓移植(BMT)后出現(xiàn)的,多系統(tǒng)損害(皮膚、食管、胃腸、肝臟等)的全身 性疾病，是造成死亡的重要原因之一。,間質(zhì)干細胞的臨床應用,促進造血和免疫功能重建 治療GVHD,心腦血管疾病 免疫系統(tǒng)疾病,間質(zhì)干細胞（MSC）的優(yōu)點,間質(zhì)干細胞在骨髓中就是造血干細胞的支持細胞,MSC的低免疫原性,MSC的免疫調(diào)節(jié)作用，降低免疫應答 MSC誘導免疫耐受,MSC表達多種趨化因子受體，體內(nèi)可趨化遷移,到受損組織和器官,間質(zhì)干細胞促進造血恢復和免疫 重建，降低GVHD,前期

29、動物試驗顯示:,1. MSC促進受體鼠的外周血白細胞、血小板、淋,巴細胞的明顯恢復；,2. 幫助胸腺、脾臟的結(jié)構(gòu)重建，加速T細胞恢復 3. 降低GVHD的發(fā)生率及嚴重程度,MSC治療慢性GVHD的臨床試用 MSC治療難治性cGVHD的臨床試用 治療慢性GVHD病人10例，其中7例病人的口腔潰瘍、皮 疹、肝功能異常、關(guān)節(jié)酸痛等癥狀有明顯好轉(zhuǎn)。 MSCs輸注量:,異體MSCs數(shù) 自體MSCs數(shù) 臍血輸注量： 有核細胞 CD34+細胞,4106/kg 8106/kg 6 107/kg 5105/kg,MSC輸注對移植物抗宿主病的療效,間質(zhì)干細胞的其他臨床應用,缺血性心臟病，如心肌梗死,缺血性腦病，如

30、腦梗死，缺血缺氧性腦病 肝臟疾病，如肝纖維化 腎臟疾病，如急性腎衰,組織工程 應用,納米材料：,成骨誘導，表面 結(jié)合DEX-Vc,與納米材料結(jié)合軟骨細胞,組織工程存在的問題,細胞和材料的相容性問題 細胞對材料表面的要求 材料的生物安全性,細胞來源安全性問題 組織生長的調(diào)控,細胞在材料內(nèi)部的功能性恢復,臨床使用上面的相容性問題,良好的生物材料的要求,1、生物相容性：組成和結(jié)構(gòu)與人體相應組織相,似，無免疫排異原性，良好生物相容性及組織相 容性，能與宿主組織愈合，誘導再生性修復。,2、生物力學順應性：滿足應用場合的生物力學,要求。,3、生物降解性：能按需要降解，做到隨再生組,織的生長而作順應性降解，

31、使組織的生長與材料 降解同步。,4、材料表面或者材質(zhì)能夠植入后，在原位誘導,組織再生。,骨組織相容性的檢測,神經(jīng)干細胞的臨床應用,脊髓損傷,缺血性腦卒中,神經(jīng)元退行性病變，如ALS、帕金森病等,胚胎干細胞的臨床應用,無限增殖、多向分化潛能,目前還存在較多的問題，主要是在動物實驗階段。 目前關(guān)于胚胎干細胞治療相關(guān)動物模型的實驗研 究較多，如帕金森病等。,胚胎干細胞其他應用,建立胚胎干細胞的體外分化模型,建立各種基因改變的胚胎干細胞系, 以求發(fā)現(xiàn)某 些基因或細胞因子在胚胎發(fā)育早期對不同類型細 胞或組織分化的作用。,利用新生（Postnatal,day 0）Nestin-GFP轉(zhuǎn) 基因小鼠研究證明多

32、 個臟器Nestin表達陽性,Sperm development defect of CDYL homozygotes F,藥物篩選的平臺,新藥在臨床使用前需要進行一系列的檢測和實驗, 這些實驗都依靠動物來完成。,但是動物模型實驗不可能完全反映藥物對人體細 胞的作用。,胚胎干細胞能模擬體內(nèi)細胞或組織對被檢測藥物 的反應, 從而提供更安全、更有效、更經(jīng)濟的藥 物篩選模型。,干細胞凍存復蘇方案,賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司,干細胞的凍存原理,在不加任何保護劑條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外 環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、 電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等， 能

33、引起細胞死亡。,如向培養(yǎng)液中加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍 結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在 130以下的低溫中能減少冰晶的形成。,細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的-,50，細胞仍能生長，活力受損不大。,干細胞凍存液的選擇,選擇一種省時高效、安全穩(wěn)定的凍存液，,是做好細胞凍存的關(guān)鍵！,什么是NCR凍存液？,Non-Control Rate NCR,無控制速率,就是降溫過程無需控制,OriCellTM NCR凍存液研發(fā)機理,高山植物復活草耐過冰雪嚴寒仍能復活，某 些昆蟲在高寒條件下可以不凍死；都是因為其自 身含有一些保護物質(zhì)，能在極端環(huán)境下保護細胞 不受損傷。,OriCellTM NCR凍存液的研發(fā)機理,Cyagen團隊模擬自然界這種神奇的自我保護能,力，在凍存液里添加了多種抗寒膜外保護劑、滲 透性保護劑及沉降穩(wěn)定劑，使細胞在低溫環(huán)境下 得到很好的保護。,OriCellTM NCR凍存液的作用機理,細胞膜保護劑-可在細胞膜外瞬間形成一層保 護膜，保護細胞不受細胞外冰晶的損害。,滲透性保護劑-可迅速滲透至細胞內(nèi)部，防止 細胞內(nèi)部產(chǎn)生大量冰晶，同時可保護細胞器，減 少其在低溫下的損傷。,細胞沉降穩(wěn)定劑-可平衡細胞沉降速度，