1、生物化學(xué)與分子生物學(xué),常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology,第二十章,第一節(jié),分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blotting Technique,核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heter

2、oduplex) 。,一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理,（一）印跡技術(shù),利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。,用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,（二）探針技術(shù),二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用,（一）DNA印跡 (Southern blotting),（二）RNA印跡 (Northern blotting),（三）蛋白質(zhì)的印跡 (Western blotti

3、ng),用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。,用于RNA的定性定量分析。,用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。,其他： 斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization) DNA點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù) (DNA chip),三種印跡技術(shù)的比較,分子雜交實(shí)驗(yàn),放射自顯影照片,DNA芯片技術(shù),第二節(jié),PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用 The Principle and Application of PCR Technology,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、PCR技術(shù)的工作原理,PCR

4、技術(shù)原理示意圖,PCR的基本反應(yīng)步驟,變性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,模板DNA 特異性引物 耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR體系基本組成成分,利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段； 利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段； 利用隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。,二、PCR技術(shù)的主要用途,（一）目的基因的克隆,利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。,PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的量要求很

5、低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。,（三）DNA和RNA的微量分析,（二）基因突變,將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度； 待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測定，也可直接測定。,PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性 。,（四）DNA序列測定,（五）基因突變分析,逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。 RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),三、幾

6、種重要的PCR衍生技術(shù),原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。 原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。,（二）原位PCR技術(shù),（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù),實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。,實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理,實(shí)時(shí)PCR分類：,圖20-3 TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR原理示意圖,第三節(jié),基因文庫 Gene Libra

7、ry,基因組DNA文庫 (genomic DNA library) cDNA文庫(cDNA library),基因文庫(gene library),是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。,一、基因組DNA文庫,基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。,用于構(gòu)建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。,基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選,第一輪篩選,第二輪篩選,第三輪篩選,基因組文庫篩選結(jié)果舉例,cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDN

8、A片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。,二、cDNA文庫,第四節(jié),生物芯片技術(shù) Biological Chip Technique,是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNA microarray)。,一、基因芯片,基因芯片(gene chip),基因芯片工作流程示意圖,是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，

9、再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。,二、蛋白質(zhì)芯片,蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng),蛋白質(zhì)芯片(protein chip),蛋白質(zhì)芯片作用原理,第五節(jié),生物大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù),酵母雙雜交 各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析 噬菌體顯示系統(tǒng)篩選,常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù),標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。,（一）標(biāo)簽蛋白沉淀,標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主

10、要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。,標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖,（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途,酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用,證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測。 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。 將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達(dá)文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。,電泳遷移率變動(dòng)測定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(gel shift assay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序