1、第三章 培養(yǎng)基及一般培養(yǎng)技術（4學時）,3.1 培養(yǎng)基的種類和成份（1學時） 3.2 培養(yǎng)基的制備（母液的配制和保存；MS培養(yǎng)基的配制）（融入實驗課）；一般操作技術（滅菌、接種、培養(yǎng)、移栽馴化）（2學時） 3.3 組培常見問題與對策（污染、褐化、玻璃化）（1學時）,第一節(jié) 培養(yǎng)基的成分和種類,一、培養(yǎng)基的成分,1、無機營養(yǎng)元素(inorganic element),1)大量元素：指濃度大于0.5mmolL的元素。 N、P、K、Mg、S和Ca等。,2)微量元素：指小于0.5mmolL的元素。 Fe，B，Mn，Cu，Mo，Cl等。,在細胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動。 種類：VBl(鹽

2、酸硫胺素)、 VB6(鹽酸吡哆醇)、 Vpp(煙酸)、 Vc（抗壞血酸）、 VH(生物素)、 VB11(葉酸)、 VB12（鈷胺素)等。 使用濃度：一般用量為0.11.0mgL。,2、維生素(vitamin),又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉化中起重要作用。 使用濃度：一般為lOOmgL， 作用：適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。,3、肌醇,培養(yǎng)基及其配制,作用：是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。 種類：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。 使用濃度：為10200mg

3、L。,4、氨基酸 (amino acid）,培養(yǎng)基及其配制,5、有機附加物 （天然復合物）,10%20%,150-200mlL,150200gL,0.01%-0.05%,濃度：,培養(yǎng)基及其配制,6、植物生長調節(jié)物質(hormone),赤霉素（gibberellic acid）,細胞分裂素類 ( cytokinin ),生長素類(auxin),培養(yǎng)基及其配制,*作用：主要被用于誘導愈傷組織形成；促進細胞脫分化；促進細胞伸長；促進生根。 在促進生長方面，根對生長素最敏感。在極低的濃度下，(10-510-8mgL)就可促進生長，其次是莖和芽。,（1）生長素類,培養(yǎng)基及其配制,吲哚乙酸：IAA（ind

4、o acetic acid） 萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid） 吲哚丁酸：IBA（indolebutyric acid） 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid),生長素種類：,培養(yǎng)基及其配制,生長素作用強弱順序：,培養(yǎng)基及其配制,種類： 6BA(6芐基腺嘌呤) Kt (kinetin 激動素) Zt (zeatin 玉米素),（2）細胞分裂素類,細胞分裂素作用： 促進細胞分裂與擴大。 誘導芽分化，促進側芽萌發(fā)，使莖增粗，抑制莖伸長。 抑制根的分化。,培養(yǎng)基及其配制,細胞分裂素作用強弱順序,培養(yǎng)基及其配制

5、,GA3（赤霉酸）： 作用：促進幼芽伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株。 赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響：當生長素赤霉素比值高時有利于木質部分化，比值低時有利于韌皮部分化。,（3）赤霉素,培養(yǎng)基及其配制,7、培養(yǎng)材料的支持物 -瓊脂(agar),固體培養(yǎng)時最好的固化劑。 用量：610gL。 瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40 即凝固為固體狀凝膠。 瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力

6、。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。,培養(yǎng)基及其配制,固體培養(yǎng)基的特點（與液體培養(yǎng)基相比）:,優(yōu)點:操作簡便，通氣問題易解決，便于觀察研究。 缺點:培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分充分利用，同時培養(yǎng)物排出的代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。,固體培養(yǎng),液體培養(yǎng),培養(yǎng)基及其配制,8、抗生物質(antibiotic),種類：卡那霉素、頭孢霉素、青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。 濃度：520mg/L。 作用：可防止菌類污染。,培養(yǎng)基及其配制,9、活性炭(active carbon),目的：是利用其吸附能力，減少一些有毒物質的影響；利于生根。 使

7、用濃度：15gL。 它的顆粒大小決定著吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；溫度低吸附力強，溫度高吸附力減弱，甚至不吸附。,培養(yǎng)基及其配制,10、水（water),作用：是植物原生質體的組成成分，也是一切代謝過程的介質和溶媒。 注意：用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。,培養(yǎng)基及其配制,二、培養(yǎng)基的PH值 (pH value),1、多數(shù)植物要求pH5.6-5.8 2、用0.1-1N的NaOH和0.1-1N的HCI調節(jié). 3、注意： 經(jīng)高壓滅菌后，培養(yǎng)基pH會下降0.2-0.8,故調整pH值時,應高于0.5； pH的大小會影響瓊脂的凝固能力，當pH6.0時，培

8、養(yǎng)基將會變硬，pH 5.0時，瓊脂凝固不好。,培養(yǎng)基及其配制,培養(yǎng)基及其配制,不同植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求不同(見表),培養(yǎng)基(culture medium) ：是植物組織培養(yǎng)的重要基質。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。,三、培養(yǎng)基的種類、配方及特點,培養(yǎng)基及其配制,1、根據(jù)態(tài)相不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基,2、根據(jù)培養(yǎng)物培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基,3、根據(jù)作用不同：誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基

9、、 生根培養(yǎng)基,4、根據(jù)營養(yǎng)水平：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、 改良培養(yǎng)基。,（一）培養(yǎng)基的種類,培養(yǎng)基及其配制,若只含有大量元素與微量元素和碳水化合物的培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)基。 在基本培養(yǎng)基的基礎上，添加各種各樣的生長調節(jié)物質和其他有機附加物的培養(yǎng)基叫完全培養(yǎng)基。,初代培養(yǎng)基： 指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基：指用來接種初代培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的培養(yǎng)基 。,培養(yǎng)基及其配制,1、MS培養(yǎng)基：它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計的。是目前應用最廣泛的培養(yǎng)基。 特點：是無機鹽離子濃度較高，有高含量的N、K，硝酸鹽量大，營養(yǎng)豐富。,（三）常用的培養(yǎng)基及特點,培養(yǎng)基及其

10、配制,（二）MS培養(yǎng)基配方,2、White培養(yǎng)基：1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計的。 特點：無機鹽濃度較低，適于生根培養(yǎng)。,3、N6培養(yǎng)基：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計的。 特點：成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含鉬。在國內已廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花粉和花藥培養(yǎng)。,培養(yǎng)基及其配制,(4)B5培養(yǎng)基:是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計的。 特點：是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。,(5)KM8P培養(yǎng)基:它是1974年為原生質體培養(yǎng)而設計的。 特點：是有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素。,培養(yǎng)基及其

11、配制,2、White培養(yǎng)基 1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計 1963年作了改良，提高MgSO4的濃度和增加硼元素 無機鹽濃度較低 使用廣泛 在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果,3、B5培養(yǎng)基 1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計 含有較低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素,B5培養(yǎng)基的組成和配方,4、N6培養(yǎng)基 1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設計 KH2PO4和（NH4）SO4含量高，不含鉬,N6培養(yǎng)基組成及配方,第二節(jié) 培養(yǎng)基的配制,一、 培養(yǎng)基的配制,（一）、母液(stock solution)的配制和保存 所謂母液是欲配制液的濃縮液。 意義: 保證各

12、物質成分的準確性 配制時的快速移取 便于低溫保藏。 一般母液配成比所需濃度高10-100倍。 母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。,培養(yǎng)基及其配制,單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用mg/ml 或mg/L表示。 混配法：將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。 配制生長素類：可先用少量0.1N的NaOH或95%酒精助溶。濃度為：1-5mgml。 配制細胞分裂素類：一般先用少量0.5-1N鹽酸加熱溶解。濃度為：1-5mgml。,培養(yǎng)基及其配制,母液的配制方法：,培養(yǎng)基母液的配制,培養(yǎng)基及其配制,配制方法： 1）

13、、將母液按順序擺放 2）、取適量的蒸餾水(所需培養(yǎng)基量的2/3)入容器 3）、按需要量依次取母液及生長調節(jié)物質 4）、加入蔗糖(30g/L)溶解 5）、加瓊脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min 5）、定容 6)、調PH值(pH=5.8) 7)、分裝培養(yǎng)瓶，封口 8)、高壓滅菌,培養(yǎng)基及其配制,第三節(jié) 組培技術（滅菌、接種、培養(yǎng)、移栽馴化）,消毒:是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。,滅菌:是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質全部殺死。,培養(yǎng)基及其配制,一、培養(yǎng)基的滅菌,常用的滅菌方法,物理方法,化學方法,干熱滅菌(烘燒和

14、灼燒),濕熱滅菌(常壓或高壓蒸煮),射線處理(紫外線、超聲波、微波),過濾除菌,大量無菌水沖洗,升汞(氯化汞),甲醛(福爾馬林),過氧化氫,高錳酸鉀,來蘇兒,漂白粉,次氯酸鈉,酒精,培養(yǎng)基及其配制,培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌法,培養(yǎng)基在制備后的24h內完成滅菌。 高壓滅菌的原理： 在密閉的蒸鍋內，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在108kPa的壓力下，鍋內溫度達121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。,培養(yǎng)基及其配制,將鍋內空氣完全排除后，關閉放氣閥。當壓力表上升達108kPa時，鍋內溫度達121（在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種

15、細菌及其高度耐熱的芽孢），維持15-30min。,培養(yǎng)基及其配制,滅菌方法：,滅菌鍋有很多種，實驗室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時要注意一下幾點： 1、鍋中應放足量的水，以免造成空燒或干燒； 2、裝鍋時不要過度傾斜，可保持內部有一定的空 間，利于蒸汽流動； 3、增壓前高壓鍋內的空氣必須排凈，否則易影響 滅菌效果；,4、滅菌過程中，應盡量保持壓力恒定，嚴格遵守滅菌時間； 5、排氣降壓時應緩慢進行； 6、只有待高壓鍋內壓力表指針恢復到零后，才能開啟壓力鍋； 7、高壓鍋工作時，應有專人看守。,高壓滅菌的原理,在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之

16、增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內溫度達121。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。,注意事項,完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。關閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時,開始計時，維持壓力0.10.15MPa 20分鐘。,在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低，二是

17、濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出226kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。 在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。 如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養(yǎng)基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，需逐漸減壓。,過濾滅(除)菌（不耐熱的物質 ）,一些生長調節(jié)劑(赤霉素、玉米素)、某些維生素是不耐熱的

18、，常用過濾滅菌-細菌過濾器方法。 防細菌濾膜網(wǎng)孔的直徑為0.45m以下，可阻止細菌細胞和真菌的孢子通過。,培養(yǎng)基及其配制,空間及物體表面滅菌,培養(yǎng)基及其配制,熏蒸劑:甲醛和高錳酸鉀，1周后通風1天。,(1)紫外線滅菌,(2)熏蒸滅菌,10-20分鐘,滅菌后的培養(yǎng)基經(jīng)冷卻和凝固后即可使用，檢驗滅菌效果。 檢驗方法： 將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室中3天，若沒有污染現(xiàn)象，說明滅菌可靠，可以使用。 保存在低溫條件下。常溫下保存時要進行防塵和避光處理。 保存時間不可過長。,培養(yǎng)基的保存,二、外植體的選擇和滅菌,1、 外植體的選擇 2、 外植體的滅菌方法 3、 污染原因和預防措施,1、外植體的選擇 植物組織培養(yǎng)的主

19、要過程大致包括：培養(yǎng)基的制備、外植體的選擇、器具的消毒、無菌操作和環(huán)境條件的調控。 1）、選擇優(yōu)良的種質 無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，或者是進行生物技術研究，選取性狀優(yōu)良的種質，或特殊的基因型。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提高成功機率，增加其實用價值。,2）、選擇健壯的植株 組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，選取發(fā)育正常的器官或組織。因為這些器官或組織代謝旺盛，再生能力強，比較容易培養(yǎng)成功。 3）、選擇最適的時期 組織培養(yǎng)選擇材料時，要注意植物的生長季節(jié)、植物的生長發(fā)育階段。如快速繁殖時應在植株生長的最適時期取材，這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高。,4）

20、、選取適宜的大小 培養(yǎng)無菌材料時，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應更小。,三、外植體的滅菌方法,1、常用滅菌藥劑的使用和效果 2、外植體的滅菌方法,1、常用滅菌藥劑的使用和效果,2、外植體的滅菌方法 外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進行預處理。植物材料一般采取的預處理方法是：先對植物組織進行修整，去掉不需要的部分，將準備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經(jīng)過預處理的植物材料，其表面仍有很多細菌和真菌，因此還需進一步滅菌。,常規(guī)的表面滅菌處

21、理方法 把材料放進70%的酒精中約30s。 用0.1%的升汞（HgCl2）浸泡5 10min 。 或用10%的次氯酸鈉溶液浸泡10 15min。 無菌蒸餾水沖洗35次。 滅菌時進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好 的接觸。 在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%的Tween20（吐溫） 或Tween80濕潤劑，則滅菌效果更好。,四、污染原因和預防措施 1、污染的原因 污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。 污染的原因：從病原菌方面來分析主要有細菌及真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外植體帶菌、培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。,細菌污染的特點：在外

22、植體附近的培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁和云霧狀痕跡。一般在接種后12天即可發(fā)現(xiàn)。 原因：材料帶菌； 培養(yǎng)基滅菌不徹底； 操作人員未遵守操作規(guī)程。 因此接種人員的手應經(jīng)常用70%酒精擦洗，鑷子、剪刀、接種針在使用前必須在火焰上燒紅。,真菌污染的特點：培養(yǎng)瓶內往往會出現(xiàn)白、黑或綠等不同顏色菌絲塊。在接種后310天才能發(fā)現(xiàn)。 原因：周圍環(huán)境不清潔； 超凈工作臺的過濾裝置失效； 培養(yǎng)瓶等器皿的口徑過大。 為了減少損失，提高工作效率，必須在每個操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生。,2、污染的預防措施,發(fā)現(xiàn)污染的材料應及時處理，否則將導致培養(yǎng)室環(huán)境污染。 對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進行更為嚴格的滅菌，然后接入新鮮的培

23、養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。 要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。,1）防止材料帶菌的措施 （1）用莖尖作外植體時，可在室內或無菌條件下對 枝條先進行預培養(yǎng)。 枝條 水洗凈 插入無糖的營養(yǎng)液或自來水 抽枝 以這種新抽的嫩枝條作為外植體 接種。這樣便可大大減少材料的污染。 在無菌條件下對采自田間的枝條進行暗培養(yǎng)，待 抽出的黃化枝條時采枝，經(jīng)滅菌后接種也可明 顯減少污染。,（2）選擇合適的時間去田間采取外植體 避免陰雨天去田間采取外植體。 在晴天采取外植體時，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經(jīng)過日曬后可殺死部分細菌或真菌。,但目前對材料內部污染還沒有令

24、人滿意的滅菌方法。在菌類長入組織內部時，不但要除去上年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內部的分生組織，以收到一定的防污染效果。,2）外植體的滅菌 （1）多次滅菌法： 首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在）； 其次，將切好的外植體放入1.3%的次氯酸鹽溶液中，滅菌30min； 第三，在無菌蒸餾水中沖洗3-5次； 第四，將材料封閉在無菌的培養(yǎng)皿中過夜，保持一定溫度； 第五，次日將葉片用2.6%次氯酸鈉滅菌30min，然后用蒸餾水洗3-5次。,（2）多種藥液交替浸泡法,對容易污染而難滅菌的材料： 首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，表面不可附著污垢、灰塵，用剪刀修

25、剪掉外植體上無用的部分，剝去芽上鱗片； 第2，將材料放入70%酒精中滅菌數(shù)秒鐘； 第3，在1：500Roccal B（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸5min； 第4，放入5%10%次氯酸鈉溶液中并滴入“吐溫80”數(shù)滴，滅菌1530min，或浸入0.1%0.2%升汞溶液中并加入“吐溫80”數(shù)滴，滅菌510min； 第5，用無菌水沖洗5次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無菌的0.1M鹽酸中浸片刻，再用無菌水沖洗數(shù)次。,3）玻璃器皿的滅菌 濕熱滅菌法即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進行高溫高壓滅菌，滅菌時間可延長達25min30min。 干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進行滅菌。 煮沸滅菌即

26、將玻璃器皿放入水中煮沸進行滅菌。,4）金屬器械的滅菌,火焰滅菌法：即把金屬器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟應當在無菌操作過程中反復進行。 干熱滅菌法：即將擦洗干凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內，放在烘箱中滅菌。,濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布質品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質品，放入高壓鍋中，121C的溫度，滅菌20 min30min。,5）布質制品的滅菌,6）無菌操作室的滅菌,無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅菌可用2%的新潔爾滅或70%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20-30min。使用前用70%的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二

27、次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。,7）操作人員在接種時一定要嚴格按照無菌操作的程序進行,在接種前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好在新潔爾滅溶液中浸泡10min，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭接種瓶表面進行消毒，以防把微生物帶進超凈工作臺。 工作人員在接種時，最好不要感冒咳嗽和說話。操作人員操作動作要熟練、動作快、規(guī)范，這樣可以縮短操作時間，減少污染。如脫毒培養(yǎng)的莖尖很小，操作時間長了就會使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌。,小 結,1、外植體的選擇 ：優(yōu)良種質、健壯植株 、最適的時期、適宜的大小。 2、外植體的滅菌方法：9種常用滅菌藥劑的使用及其效果 、外植體的滅菌方法。 3、污染原

28、因和預防措施：污染的原因、污染的預防措施（防止材料帶菌、外植體的滅菌、器皿與金屬器械的滅菌、布質制品的滅菌、無菌操作室的滅菌、操作人員在接種時一定要嚴格按照無菌操作的程序進行）。,四、 外植體的接種和培養(yǎng) 1、 外植體的接種 2、 培養(yǎng)條件,1、外植體的接種,外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料在無菌環(huán)境中切割或分離出器官、組織、細胞并轉入到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。 操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應特別注意防止工作人員本身引起的污染。 整個接種過程均須無菌操作：,酒精擦拭手,外植體消毒,浸泡5min,器械消毒,酒精燈灼燒,接種的具

29、體操作,旋轉灼燒,取外植體,接種,蓋好瓶塞,1操作人員需穿著經(jīng)消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。進入接種室前，雙手必須進行消毒，用肥皂和水洗滌能達到良好的效果, 進行操作前再用75%的酒精擦洗雙手。 2操作期間經(jīng)常用75%的酒精擦拭雙手和臺面。特別注意防止“雙重傳遞”的污染，例如器械被手污染后又污染培養(yǎng)基等。,3在打開培養(yǎng)瓶、三角瓶或試管時，最大的污染危險是管口邊沿沾染的微生物落入管內，解決這個問題，可在打開前用火焰燒瓶口。如果培養(yǎng)液接觸了瓶口，則瓶口要燒到足夠的熱度，以殺死存在的細菌。為避免灰塵污染瓶口，可用紙包扎瓶口和塞子，以遮蓋瓶子頸部和試管口，相對地減少污染機會。,4工具用后及時消

30、毒，避免交叉污染。 5工作人員的呼吸也是污染的主要途徑。通常在平靜呼吸時細菌是很少的，但是談話或咳嗽時細菌便增多，因此操作過程應禁止不必要的談話并戴上口罩。,6由于空氣中有灰塵，因此在操作時，仍要注意避免灰塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當打開瓶子或試管時，應拿成斜角，以免灰塵落入瓶中。刀、剪、鑷等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用時在火焰上消毒，待冷卻后使用。每次使用前均需進行用具消毒。,外植體的培養(yǎng)條件 接種后的外植體應送到培養(yǎng)室去培養(yǎng)。組織培養(yǎng)的優(yōu)點之一就是在人工控制的環(huán)境條件下，使培養(yǎng)物生長發(fā)育，研究植物的生命活動。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件要根據(jù)植物對環(huán)境條件的不同需求進行調控。其中最主要的是

31、光照、溫度、濕度、氧氣和培養(yǎng)基的pH值等。,1、光照 對離體培養(yǎng)物的生長發(fā)育，光照條件有重要的作用。通常對愈傷組織的誘導，在黑暗條件下有利，在有光條件下培養(yǎng)的愈傷組織質地和顏色也有不同。但分化器官需要光照，并隨著芽苗的生長需要加強光照。加強光照，可以使小苗生長健壯，促進“異養(yǎng)”向“自養(yǎng)”轉化，提高移植的成活率。普通培養(yǎng)室要求每日光照12h-16h，光照強度1000lx-5000lx。如果培養(yǎng)材料要求在黑暗中生長，可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周圍，或置于暗室中培養(yǎng)。,2溫度 離體培養(yǎng)中對溫度的調控要比光照顯得更為突出。不同的植物有不同的最適生長溫度，大多數(shù)植物最適溫度在23C-32C之

32、間。培養(yǎng)室一般所用的溫度是25C2C。低于15C或高于35C，對生長都是不利的。,3濕度 組織培養(yǎng)中的濕度影響主要有兩個方面，一是培養(yǎng)容器內的濕度，它的濕度條件?？杀ＷC100%。二是培養(yǎng)室的濕度，它的濕度變化隨季節(jié)和天氣而有很大變動。濕度過高過低都是不利的，過低會造成培養(yǎng)基失水而干枯，或滲透壓升高，影響培養(yǎng)物的生長和分化；濕度過高會造成雜菌滋長，導致大量污染。因此，要求室內保持70%-80%的相對濕度。,4氧氣 植物組織培養(yǎng)中，外植體的呼吸需要氧氣。在液體培養(yǎng)中，振蕩培養(yǎng)是解決通氣的良好辦法。,低CTK/IAA,外植體,愈傷組織,芽,根,脫分化,再分化,低CTK/IAA,根,完 整 植 株,生

33、長調節(jié)物質控制器官分化的模式,芽,高CTK/IAA,低CTK/IAA,不定芽形成-多細胞參與,胚狀體形成過程-單細胞參與,體細胞胚的發(fā)育過程,五、試管苗的馴化與移栽 試管苗的特點 1.試管苗的生態(tài)環(huán)境 組織培養(yǎng)中培育出來的苗通常稱試管苗或組培苗。由于試管苗長期生長在試管或三角瓶等培養(yǎng)器皿中，與外界環(huán)境隔離，形成了一個獨特的生態(tài)系統(tǒng)。 與外界環(huán)境條件相比具有以下4大差異，即高溫、高濕、弱光和無菌。,（1）高溫且恒溫 在植物試管苗整個生長過程中，通常均采用恒溫培養(yǎng)，即使某一階段稍有變動，溫差也是極小的；并且在培養(yǎng)過程中，通常溫度控制在252，有的植物需將溫度控制得更高；而外界環(huán)境條件，溫度處于不斷

34、變化之中，溫度的調節(jié)完全是由自然界太陽輻射的日輻射量決定的，溫差很大，而且一般不會達到252。,（2）高濕 植物組織培養(yǎng)中試管或培養(yǎng)瓶內的水分移動有2條途徑，一是試管苗吸收的水分，從葉面氣孔蒸騰；二是培養(yǎng)基向外蒸發(fā)，而后水汽凝結又進入培養(yǎng)基。這種循環(huán)就是培養(yǎng)瓶內的水分循環(huán)，其循環(huán)的結果造成培養(yǎng)瓶內空氣的相對濕度接近于100，遠遠大于培養(yǎng)瓶外的空氣濕度，所以試管苗的蒸騰量極小。可見培養(yǎng)瓶內的水分狀態(tài)直接影響著試管苗的生長和各種生理活性。,（3）弱光 組織培養(yǎng)中的光強與太陽光相比一般很弱，故幼苗一般生長也較弱，經(jīng)受不了太陽光的直接照射。,（4）無菌 不僅培養(yǎng)基無菌，而且試管苗也無菌。在移栽過程中試

35、管苗要經(jīng)歷由無菌向有菌的轉換。這一點若不注意，也會引起試管苗移栽過程中的死亡。另外，試管苗還處在一種特殊的氣體環(huán)境中。 以上這些特點都決定了試管苗移栽前后的環(huán)境條件有極大的差異，只有有效地使試管苗適應這種差異，才能使之移栽成活，這就需要試管苗有一定的馴化時期。,2. 試管苗的特點 試管苗與常規(guī)苗相比具有如下特點： 1、試管苗生長細弱，莖、葉表面角質層不發(fā)達； 2、試管苗莖、葉雖呈綠色，但葉綠體的光合作用功能較差； 3、試管苗的葉片氣孔數(shù)目少，活性差 4、試管苗根的吸收功能弱。,二、試管苗的馴化 馴化的目的:在于提高試管苗對外界環(huán)境條件的適應性，提高其光合作用的能力，促使試管苗健壯，最終達到提高

36、試管苗的移栽成活率。,馴化的原則：應從溫度、濕度、光照及有菌等環(huán)境要素進行，馴化開始數(shù)天內，應和培養(yǎng)時的環(huán)境條件相似；馴化后期，則要與預計的栽培條件相似，從而達到逐步適應的目的。,馴化的方法： 馴化一般在試管苗移栽前進行，首先進行移栽前的馴化鍛煉（即練苗），其具體方法：將長有完整試管苗的試管或三角瓶由培養(yǎng)室轉移到半遮蔭的自然光下進行鍛煉，在自然光下恢復植物體內葉綠體的光合作用能力和健壯度，并打開瓶蓋注入少量自來水使幼苗逐漸降低溫度，轉向有菌，這樣幼苗周圍的環(huán)境就會逐步與自然環(huán)境相似。馴化一般進行12周。,三、試管苗的移栽 試管苗的移栽往往和馴化同步。移栽的方法有：常規(guī)移栽法、直接移栽法和嫁接移

37、栽法。,1常規(guī)移栽法 常規(guī)移栽法是指將試管苗在生長素濃度高的培養(yǎng)基上誘導生根，當獲得大量的不定根后，打開培養(yǎng)瓶注入少量自來水，在半遮光下馴化35d，然后取出洗去培養(yǎng)基，移栽到無菌的混合土（如沙子：蛭石=1：1）中，保持一定的溫度和水分，當長出23片新葉時就可將其移栽到田間或盆缽的方法。,2直接移栽法 直接移栽法是指直接將試管苗移栽到盆缽的方法。 3嫁接移栽法 嫁接移栽法是指選取生長良好的同一植物的實生苗或幼苗作砧木，用試管苗作接穗進行嫁接的方法。據(jù)王清連等人對棉花的試管苗進行嫁接移栽試驗表明，試管苗的嫁接移栽法與常規(guī)移栽法相比優(yōu)點見下表：,表2-4 嫁接移栽法移栽棉花試管苗的效果,四、影響試管

38、苗移栽成活率的因素 影響試管苗移栽成活率的因素有許多種，包括內因與外因。不同的植物和不同的試管苗種類對移栽的具體要求是不同的。但是總的來說，提高試管苗移栽成活率的途徑有以下幾種。,試管苗的馴化,藍莓,1試管苗的生理狀況（選擇壯苗） 試管苗的生理狀況是影響移栽成活率的內在因素。同一種植物的試管苗，其壯苗比弱苗移栽后成活率高。,嫁接移栽法移栽棉花試管苗的效果,2植物生長調節(jié)物質 一般來說生長素因為能促進生根，故也能提高試管苗移栽的成活率。但是，不同的植物有其適宜的生長素種類。如在月季的試驗中發(fā)現(xiàn)，以NAA誘導生根和提高移栽成活率效果最好；而IAA并不理想，當IAA的濃度超過1mg/L時，反而急劇降

39、低移栽成活率。細胞分裂素一般會抑制根的生長，不利于移栽。如在月季的試驗中表明，無論是BA或2-ip對生根和移栽都有抑制效應，即使在很低的濃度下也可發(fā)現(xiàn)。,3無機鹽濃度 試驗結果表明，降低無機鹽的濃度對植物生根效果較好，有利于移栽成功。,4活性炭 在生根培養(yǎng)基中加入少許活性炭，對某些月季的嫩莖生根有良好作用，尤其是采用酸、堿和有機溶劑洗過的活性炭，效果更佳。,5環(huán)境因子 環(huán)境條件也影響試管苗移栽的效果，關鍵是控制好移栽前10d的光、溫、濕。做好適當遮陰工作，避免太陽光直射造成試管苗迅速失水而死亡。溫度一般保持在2530為好。開始幾天最好用燒杯罩住移栽苗，使其周圍的相對濕度保持在85%以上。,6從

40、無菌向有菌逐漸過渡 試管苗出管后，要將其上面的培養(yǎng)基洗凈，以免雜菌滋長。對于移栽后成活比較困難的植物，第一次移栽時最好選用滅菌過的基質，以提高其移栽成活率。,第三節(jié) 外植體的褐變及其預防措施,葡萄嫩莖接種48h,馬鈴薯莖尖接種40d,褐變：是指外植體在培養(yǎng)過程中自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放出褐色物質，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。,一、褐變的概念,褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物 多少和多酚氧化酶活性有直接關系。酚類很不穩(wěn) 定，溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶 的催化下迅速氧化成褐色的醌類物質和水，醌類又 會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白 質

41、發(fā)生聚合，進一步引起其他酶系統(tǒng)失活，從而導 致組織代謝紊亂，生長停滯不前，最終衰老死亡。,二、褐變的原因,植物材料不同，褐變的程度有所不同。,三、影響褐變的因素,棗,蝴蝶蘭,蘋果,環(huán)境、培養(yǎng)基、轉接周期不同，褐變的程度不同。,1、植物材料 （1）基因型 不同種植物，同種植物不同類型、不同品種在組織培養(yǎng)中褐變發(fā)生的頻率、嚴重程度都存在很大差別。木本植物（木質素）、單寧含量或色素含量高的植物容易發(fā)生褐變。這是因為酚類的糖苷化合物是木質素、單寧和色素的合成前體，酚類化合物含量高，木質素、單寧或色素形成就多，而酚類化合物含量高將導致褐變的發(fā)生，因此，木本植物一般比草本植物容易發(fā)生褐變。,蘋 果,苜 蓿

42、,（2）材料年齡 幼齡材料一般都比成齡材料褐變輕的趨勢。幼齡材料褐變較輕與其酚類化合物含量少有關。Chever 分析歐洲栗的酚類含量變化的結果表明，幼齡材料酚類化合物含量少，而成齡材料比較多。平吉成從山定子剛長成的實生苗上切取莖尖進行培養(yǎng)，接種后褐變很輕，隨著苗齡增長，褐變逐漸加重，取自成齡樹上的莖尖褐變就更嚴重。,梨一年生枝、二年生枝接種3d,（3）取材部位 Yu和Meredith在葡萄上發(fā)現(xiàn)從側生蔓切取莖尖進行培養(yǎng)，比從延長蔓切取的莖尖更容易成活，進一步分析酚類含量發(fā)現(xiàn)前者比后者少。而蘋果則頂芽作外植體褐變程度輕，比側芽容易成活。石竹和菊花也是頂端莖尖比側芽莖尖更容易成活。,（4）取材時期

43、 多酚氧化酶活性和酚類含量基本是對應的，春季較弱，隨著生長季節(jié)的到來，酶活性逐漸增強，因而有人認為取材時期比取材部位更加重要。Chever報道，歐洲栗在3月15日-30日醌類物質形成少，而在5月-6月醌類物質明顯提高。,蔣迪軍和牛建新報道，金冠蘋果莖尖小于0.5mm時褐變嚴重,當莖尖長度在5mm-15mm時褐變較輕,成活率可達85%。在多個蘋果品種上試驗結果表明，用5mm-10mm長的莖尖進行培養(yǎng)效果最好，莖尖如果太小很容易發(fā)生褐變。另外，取外植體時還要考慮其粗度，細的可切短些，粗的可切得長些。,（5）外植體大小,主要是光照與溫度。溫度過高或光照過強，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速外植體

44、的褐變。,2、培養(yǎng)條件,（1）培養(yǎng)基狀態(tài) 由于培養(yǎng)基中瓊脂的用量和pH值的高低不同，培養(yǎng)基可配成固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。許多試驗證明，液體培養(yǎng)基可以有效克服外植體褐變，液體培養(yǎng)基再加上濾紙橋，效果就更好。在液體培養(yǎng)基中，外植體溢出的有毒物質可以很快擴散，因而對外植體造成的傷害較輕。,3、培養(yǎng)基,（2）無機鹽 在初代培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中無機鹽濃度過高，酚類物質將會大量外溢，導致外植體褐變。原因是無機鹽中的有些離子，如Mn2+、Cu2+是參與酚類合成與氧化酶類的組成成分或輔因子，因此鹽濃度過高會增加這些酶的活性，酶又進一步促進酚類合成與氧化。,（3）植物生長調節(jié)物質 初代培養(yǎng)處在黑暗條件

45、下，生長調節(jié)物質的存在是影響褐變的主要原因，此時去除生長調節(jié)物質可減輕褐變。細胞分裂素6-BA或KT不僅能促進酚類化合物的合成，而且還能刺激多酚氧化酶的活性，這一現(xiàn)象在甘蔗的組織培養(yǎng)中明顯。而生長素類如2，4-D和IAA可延緩酚類化合物的合成，減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生。,（4）抗氧化劑 培養(yǎng)基中加入抗氧化劑可改變外植體周圍氧化還原電勢，從而抑制酚類氧化，減輕褐變。,（5）吸附劑 活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作為吸附劑可以去除酚類氧化造成的毒害效應，這在東北紅豆杉、豬籠草、鶴望蘭、杜鵑花、蘋果、桃和倒掛金鐘等植物上都有過報道。在倒掛金鐘莖尖培養(yǎng)中只加入0.01%PVP便對褐變有抑制作用。,（6）pH

46、值 培養(yǎng)基的pH值較低時，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，從而抑制褐變。而pH值升高則明顯加重褐變。,4、材料轉瓶周期 對于易褐變的材料，接種后轉瓶時間長，傷口周圍積累醌類物質增多，褐變加重，以致全部死亡。而縮短轉瓶周期可減輕褐變。在山月桂樹的莖尖培養(yǎng)中，接種后12h24h，便轉入液體培養(yǎng)基中，這之后的一周內，每天轉一次瓶，褐變得到完全控制。在無刺黑莓上也有類似經(jīng)驗 。,褐變的預防措施,1選擇適宜的外植體 外植體應選擇分生能力較強的材料。如采用實生苗莖尖、枝條頂芽、幼胚等材料培養(yǎng)褐變程度比較輕。 2采用適宜的培養(yǎng)基和光溫條件 培養(yǎng)基的無機鹽成分、蔗糖濃度、激素水平、溫度適宜及在黑暗條件下培養(yǎng)

47、，或在取外植體之前對母株進行遮光處理20d40d，可以顯著減輕材料的褐變。,3在培養(yǎng)基中加活性炭、抗氧化劑和其他抑制劑 在培養(yǎng)基中加入0.1%0.5%的活性炭對吸附酚類氧化物的效果很明顯。在許多熱帶樹木的組織培養(yǎng)中均曾觀察到活性炭防止外植體褐變的明顯效果。如在培養(yǎng)基中加抗壞血酸、血清蛋白、有機酸、蛋白質、氨基酸等抗氧化劑和其他抑制劑，或用它們進行材料的預處理或預培養(yǎng)，可有效地預防醌類物質的形成。 4縮短轉瓶周期 這是組培中控制褐變常用且有效的方法。,第四節(jié)、玻璃化現(xiàn)象及其預防措施,玻璃化現(xiàn)象 是指組培苗出現(xiàn)葉、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小腫脹，失綠，葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表皮缺少

48、角質層蠟質，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織；體內含水量高，但干物質、葉綠素、蛋白質、纖維素和木質素含量低的現(xiàn)象。,二、玻璃化苗的危害性 由于其組織畸形，吸收養(yǎng)料與光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很難繼續(xù)用作繼代培養(yǎng)和擴大繁殖的材料；加上生根困難，很難移栽成活。,三、玻璃化的原因 玻璃化的起因是細胞生長過程中的環(huán)境變化。試管苗為了適應變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。 產(chǎn)生玻璃化苗的因素主要有激素濃度、瓊脂用量、溫度、離子水平、光照時間、通風條件等。,1、激素濃度 激素濃度增加尤其是細胞分裂素濃度提高（或細胞分裂素與生長素比例高），易導致玻璃化苗的產(chǎn)生。,2、瓊脂濃度 培養(yǎng)基中瓊脂濃度低時玻璃化苗比例增加，水浸狀嚴重，苗向上長。隨著瓊脂濃度的增加，玻璃化苗比例減少，但由于硬化的培養(yǎng)基影響了養(yǎng)分的吸收，試管苗生長減慢，分蘗亦減少。因此，瓊脂的濃度一定要適當。,3、溫度 適宜的溫度可以使試管苗生長良好，當溫度低時，容