1、重組DNA,大腸埃希菌,俗名大腸桿菌 是人和動物腸道中最主要的細(xì)菌之一 是正常菌群的成員 出生后數(shù)小時就進(jìn)入腸道，并伴隨終生 能合成維生素B和K，供人體利用 能抑制腐敗菌及病原菌（如金黃色葡萄球菌、志賀菌屬） 真菌（如白念珠菌）的過度增殖 異位寄居時可引起腸外感染 某些菌株有致病性消化道感染，導(dǎo)致腹瀉等 每個人每天平均從糞便中排出1011到1013個 可作為糞便污染的檢測指標(biāo) 常作為細(xì)菌的模式生物廣泛用于科學(xué)研究 基因工程的工具菌,生物學(xué)性狀,形態(tài)與染色 G- 桿菌，13m（短桿菌） 兩端鈍圓、無芽孢 有周鞭毛 有普通菌毛/性菌毛,能運(yùn)動,衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢查,大腸菌群 指37OC24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)

2、酸產(chǎn)氣 包括埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬及腸桿菌屬等 大腸菌群指數(shù) 指1000 ml被檢樣品中的大腸菌群數(shù) 生活飲用水的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)coli-index 3個 我國2007年開始實施的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定 每100ml生活飲用水中，不得檢出總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希菌,1、細(xì)菌培養(yǎng)-平板培養(yǎng),劃線法培養(yǎng),涂布法培養(yǎng),大腸桿菌的培養(yǎng),限制性內(nèi)切酶,EcoR I內(nèi)切酶,限制性內(nèi)切酶:一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。,分子剪刀,沃納阿爾伯,1929年生于瑞士。蘇黎士工

3、科大學(xué)畢業(yè)后，在日內(nèi)瓦大學(xué)獲得博士學(xué)位。1971年起，任巴塞爾大學(xué)教授。在研究噬菌體的遺傳現(xiàn)象時，成功地分離出DNA的限制性酶和甲基化修飾酶，為此獲1978年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎。,限制修飾現(xiàn)象,K, （B）, （B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的噬菌體,第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生長受寄主限制,K, （K）,存活下來的噬菌體再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制,EOP:Efficiency of plating（生長在不同寄主中的噬菌體的成斑率，表示限制程度）,說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來的DNA； 10-4的存活率是由宿主限制系統(tǒng)作用的結(jié)果,產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因

4、何在,甲基化酶：能使細(xì)胞自身核酸的內(nèi)切酶識別序列的堿基甲基化，從而使自身核酸免受內(nèi)切酶水解細(xì)菌的“防御”系統(tǒng),核酸內(nèi)切酶：識別并水解外源DNA（外來核酸在內(nèi)切酶識別序列上沒有甲基化修飾作保護(hù)）,研究發(fā)現(xiàn)：原來是由兩種酶配合完成，一種是起修飾作用的甲基化酶，另一種是核酸內(nèi)切酶,限制,修飾,限制修飾體系,K, （B）, （K）, （B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的噬菌體,K, （K）,再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已經(jīng)對其進(jìn)行了修飾）, （B）噬菌體感染大腸桿菌K菌株后，其DNA大部分被內(nèi)切酶降解了，但有極少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成。,在限制

5、修飾系統(tǒng)中，限制作用是指一定類型的細(xì)菌可以通過限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA（如噬菌體DNA等），使得外源DNA對生物細(xì)胞的入侵受到限制； 而宿主細(xì)胞自身的DNA分子合成后，通過修飾酶的作用：在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭自身限制性酶的破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中修飾作用的含義。 限制修飾體系，其功能就是保護(hù)自身的DNA，分解外來的DNA，以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定，這對細(xì)菌的生存和繁衍具有重要意義。,分類,核酸內(nèi)切酶：,按限制性酶的組成、限制和修飾活性、切斷核酸的情況不同，分三類（I， II ，III），通常指的是II型。,命名法,H i n d III,同一菌

6、株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶,如從流感嗜血桿菌d菌株（Haemophilus influenzae d）先后發(fā)現(xiàn)3種限制性酶，則分別命名為HindI， HindII，HindIII,前3個字母代表來源的生物 隨后1個字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株 最后1個羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序,基本特征,識別并切割雙鏈DNA（環(huán)狀或線狀）分子中4-8bp的特定序列 結(jié)構(gòu)特征：旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu) 切割后產(chǎn)生的末端：Cohesive terminus or Blunt end（粘性末端或平末端）,EcoR I的識別序列,5G C T G A A T T C G A G 3 3C G A C T T A A

7、 G C T C 5,EcoR I的切割位點(diǎn),質(zhì)粒,質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。,萊德伯格（19252008），美國遺傳學(xué)家。細(xì)菌遺傳學(xué)的創(chuàng)始人之一。1925年5月23日生于美國蒙特克萊市。1944年獲哥倫比亞大學(xué)學(xué)士學(xué)

8、位，以后曾在醫(yī)學(xué)院學(xué)習(xí)，不久轉(zhuǎn)入耶魯大學(xué)，于1947年獲博士學(xué)位。1959年起任斯坦福醫(yī)學(xué)院教授兼遺傳學(xué)系主任。1962年任肯尼迪分子醫(yī)學(xué)實驗室主任。 他在耶魯大學(xué)期間，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的遺傳重組。1946年，他和E.L.塔特姆發(fā)現(xiàn)遺傳重組的普遍性。1952年發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的F因子。1952年發(fā)現(xiàn)沙門氏菌中的普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)，1953年發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的溫和噬菌體在染色體上占有一定位置。1956年發(fā)現(xiàn)噬菌體能進(jìn)行局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。他們的研究工作還包括應(yīng)用細(xì)菌的有性生殖和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行細(xì)菌的免疫學(xué)和代謝作用等方面的研究。 1958年他和G.W.比德爾和E.L.塔特姆共同獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。,接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),接合：指通過細(xì)菌細(xì)

9、胞的直接接觸，遺傳物質(zhì)從供體轉(zhuǎn)移到受體并發(fā)生重組的過程。,1946年萊德伯格和塔特姆發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的接合。,細(xì)菌的雜交實例（1946）,不同營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌（K12）： A菌株：met- bio- thr+ leu+ thi+，,B菌株：met+ bio+ thr- leu- thi-,這種野生型細(xì)胞如何出現(xiàn)的？,U型管實驗：A、B菌株分別培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基上 一邊加壓和吸引使培養(yǎng)液充分混合 結(jié)果任何一臂的培養(yǎng)基上均未長出野生型細(xì)菌。,結(jié)論：菌株A與菌株B細(xì)胞直接接觸（接合）是野生型細(xì)胞出現(xiàn)的必要條件；兩菌株直接接觸后導(dǎo)致遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而發(fā)生基因重組，產(chǎn)生野生型細(xì)菌。,試驗證明： 接合過程是一

10、種單向轉(zhuǎn)移，A菌株遺傳物質(zhì) B菌株，從供體到受體。,用大腸桿菌K12的菌株A和菌株B，首先用高劑量的鏈霉素處理菌株A或菌株B ，把處理過的菌株A跟未處理過的菌株B混合，或把處理過的菌株B跟未處理過的菌株A混合，發(fā)現(xiàn)結(jié)果大不相同：, F 因子：致育因子或稱性因子，是一種附加體。,攜帶F因子的菌株稱為供體菌或雄性，用F表示。,未攜帶F因子的菌株為受體菌或雌性，用F表示。,F因子及F向F的轉(zhuǎn)移, F因子的結(jié)構(gòu),染色體外遺傳物質(zhì)（質(zhì)粒），環(huán)狀DNA，9104 bp，大約為大腸桿菌環(huán)狀染色體的2%，具有4060個蛋白質(zhì)基因。,每個細(xì)胞（F）有24個。,F因子分為三個區(qū)域： 自主復(fù)制區(qū)：有轉(zhuǎn)移的起點(diǎn)和2個

11、復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)Ori T是在染色體轉(zhuǎn)移時進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制時的復(fù)制起點(diǎn)；Ori V是在營養(yǎng)時期，即游離在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立復(fù)制時的復(fù)制起點(diǎn)。 轉(zhuǎn)移區(qū)：主要有合成性傘毛即F纖毛（F pili）的操縱子。F纖毛是由性 傘毛蛋白構(gòu)成，呈管狀，又叫接合管。通過接合管可將供體和受體細(xì)胞相聯(lián)。共30kb長，有40個基因與DNA的轉(zhuǎn)移有關(guān)。 重組區(qū)：有4個插入順序（IS），通過和宿主染色體 上的IS同源重組或通過轉(zhuǎn)座，F(xiàn)因子可以整合到宿主不同位點(diǎn)上。, F 因子的三種狀態(tài),有一個自主狀態(tài)的F因子，即F細(xì)胞；,帶有一個整合的F因子的細(xì)胞叫高頻重組細(xì)胞，Hfr細(xì)胞。,沒有F因子，即F細(xì)胞；,F與F菌 （1）有F因子的細(xì)

12、菌稱為F，細(xì)菌增殖時可把F 因子傳遞給后代細(xì)胞（通過自主復(fù)制）。 （2）沒有F因子的細(xì)菌稱為F，F(xiàn)細(xì)菌經(jīng)吖啶 橙處理而丟失，成為F。F因子一經(jīng)丟失， 細(xì)胞中便不再出現(xiàn)； （3）F可以和F雜交，而不能和F雜交； （4）F菌與F菌混合（即FF）1小時后，約95%的F菌轉(zhuǎn)變?yōu)镕菌，而原來的F仍然保留有F因子。,(1) F纖毛合成：由性傘毛蛋白構(gòu)成，接合管使供體和受體細(xì)胞接觸。 (2) 轉(zhuǎn)移啟動：F因子從轉(zhuǎn)移復(fù)制起點(diǎn)(Ori T)開始向F 轉(zhuǎn)移（ 5端首先進(jìn)入受體）。 (3) 單鏈轉(zhuǎn)移，滾環(huán)復(fù)制。,F纖毛與接合管,FF,Hfr 是F因子整合到E.coli 染色體上的結(jié)果,E.coli染色體上有20個以

13、上的整合位點(diǎn)； 整合通過IS等同源重組或轉(zhuǎn)座實現(xiàn)； F因子有多個整合位點(diǎn)，主要在IS3處。,分子克隆,pUC18,pUC19,含四個部分： （1）來自pBR322的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ori）； （2）ampr ; （3）大腸桿菌半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼-肽鏈的DNA序列； （4）多克隆位點(diǎn)（MCS）,lacZ,Ori,Ampr,MCS,藍(lán)白斑篩選重組子的原理：,lacZ 編碼半乳糖苷酶的肽，在異丙基硫代- -D-半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷（X-gal）被分解產(chǎn)生藍(lán)色。因此攜帶空載體的大腸桿菌呈藍(lán)色菌落。 外源基因的插入使肽失活，因而攜帶外源基因的重組子菌落呈白色。,利用菌落顏色篩選重組子,PUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：,基因組小，拷貝數(shù)高，DNA產(chǎn)量高； 有LacZ篩選標(biāo)記，LacZ基因插入失活，可用藍(lán)白斑篩選陽性克?。?有MCS，其中有13個以上的單一限制位點(diǎn)，可用于外源基因克隆。,意義與應(yīng)用,重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用開辟了分子遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創(chuàng)造新物種的大門。它的成就對于工業(yè)、農(nóng)