1、植物微核檢測(cè)技術(shù),哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 遺傳教研室 2010年3月,背景知識(shí)毒理遺傳學(xué)：,或稱遺傳毒理學(xué)，用遺傳學(xué)方法研究環(huán)境因素對(duì)遺傳物質(zhì)的損害及其毒理效應(yīng)的遺傳學(xué)分支學(xué)科，提供了許多迅速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的方法來檢測(cè)各種環(huán)境因素對(duì)遺傳結(jié)構(gòu)的危害，以便采取措施，減少這些因素對(duì)人類的危害。 應(yīng)用：評(píng)價(jià)各種化學(xué)物的安全性（藥物的臨床過渡），人類環(huán)境的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)、人群健康監(jiān)測(cè)（職業(yè)病的防治）以及遺傳毒性與疾病、腫瘤的流行病學(xué)調(diào)查等。,環(huán)境中可產(chǎn)生誘變的因素：,物理誘變：如紫外線，X-射線，-射線，快中子，激光，微波，離子束等。 化學(xué)誘變：如烷化劑(包括EMS、EI、NEU、NMU、DES、M

2、NNG、NTG等)，天然堿基類似物,氯化鋰、亞硝基化合物、疊氮化物、堿基類似物、抗生素、羥胺和吖啶等嵌入染料。 空間誘變：宇宙系列生物衛(wèi)星、科學(xué)返回衛(wèi)星、空間站及航天飛機(jī)等空間飛行器進(jìn)行搭載。 復(fù)合誘變：兩種或多種誘變劑的先后使用。,環(huán)境因素造成的遺傳毒理效應(yīng)：“三致效應(yīng)”,突變形成：環(huán)境因素誘發(fā)生殖細(xì)胞的基因突變（點(diǎn)突變）和染色體畸變，從而造成子代遺傳性疾病發(fā)生頻率的增加， 癌形成：環(huán)境因素誘發(fā)體細(xì)胞基因突變或在親代遺傳的突變形成的背景上誘發(fā)體細(xì)胞突變，引起的體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的作用； 致畸效應(yīng)：環(huán)境因素作用于發(fā)育中的胚胎細(xì)胞干擾了基因的正常作用，從而影響到胚胎細(xì)胞分化和器官系統(tǒng)的發(fā)育而

3、導(dǎo)致畸胎的發(fā)生，也包括環(huán)境因素誘發(fā)親代生殖細(xì)胞的基因突變或染色體畸變引起畸胎的作用。,“三致效應(yīng)”的檢測(cè)方法：,早期的方法：用待測(cè)化學(xué)物質(zhì)喂飼、注射動(dòng)物或涂布在動(dòng)物皮膚上，然后觀查動(dòng)物是否因此而患腫瘤或出現(xiàn)畸胎等，可檢測(cè)各種化學(xué)物質(zhì)的致癌和在胚胎發(fā)育過程中的致畸效應(yīng)。 現(xiàn)在一般都采用細(xì)菌、離體培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物和人類體細(xì)胞、植物為測(cè)試對(duì)象，主要的方法有： 以基因突變?yōu)橹笜?biāo)的檢測(cè)法 以染色體為指標(biāo)的方法,以染色體為指標(biāo)的“三致效應(yīng)”的檢測(cè)方法：,經(jīng)典的染色體畸變分析方法； 姐妹染色單體互換測(cè)試法； 微核測(cè)試法。,（1）斷片 （2）雙著絲點(diǎn) （3）環(huán),遺傳毒理評(píng)價(jià)所用的材料：,利用植物、昆蟲（果蠅）、

4、水生動(dòng)物等生物的細(xì)胞可以現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)水源、空氣及作業(yè)環(huán)境中遺傳毒物的存在。為此，發(fā)展了紫露草花序、蠶豆根尖、魚紅細(xì)胞遺傳毒性試驗(yàn)方法以及Ames（原生動(dòng)物）空氣現(xiàn)場(chǎng)采樣方法等。 動(dòng)物細(xì)胞：小鼠骨髓細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等。 應(yīng)用多種人類細(xì)胞：口腔粘膜細(xì)胞、鼻腔粘膜細(xì)胞、頭皮毛囊細(xì)胞、痰液細(xì)胞等檢測(cè)微核、染色體畸變、姐妹染色單體互換率等指標(biāo)，對(duì)人類接觸遺傳毒物的劑量及效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。,微核測(cè)試法： （micronucleus test, MNT）,20世紀(jì)70年代初期由Matter和Schmid首先建立了一種簡(jiǎn)便、快速、評(píng)價(jià)客觀地檢測(cè)來自環(huán)境中的各種理化及生物因子對(duì)機(jī)體產(chǎn)生潛在的遺傳損傷方法，即用哺乳動(dòng)

5、物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核（polychromatic erythrocyte, PCE）出現(xiàn)率的實(shí)驗(yàn)方法。,由于大量新的化合物的合成、原子能的應(yīng)用、各種工業(yè)廢物的排出，需要有一套高度靈敏、技術(shù)簡(jiǎn)單的測(cè)試系統(tǒng)來監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核生物的測(cè)試結(jié)果更能直接推測(cè)反映誘變物質(zhì)對(duì)人類或其他高等生物的遺傳危害，微核測(cè)試是一種比較理想的方法。 目前國內(nèi)外已把微核測(cè)試用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、食品添加劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。,智能全自動(dòng)微核分析系統(tǒng)：,法國IMSTAR,本實(shí)驗(yàn)的目的：,通過植物根尖微核試驗(yàn)，學(xué)習(xí)微核的制片技術(shù)、識(shí)別及計(jì)數(shù)方法。 掌握評(píng)價(jià)理化因子對(duì)機(jī)體遺傳損

6、傷的快速篩選方法。,實(shí)驗(yàn)原理：,微核（micronucleus, MN）是真核生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)。由于細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物等作用使染色體受到損傷，在有絲分裂中、后期細(xì)胞中形成喪失著絲粒的染色體單體或染色體斷片，游離于子細(xì)胞質(zhì)中形成的次核。在間期細(xì)胞中，常常見到比普通細(xì)胞核小很多的一個(gè)或幾個(gè)圓形結(jié)構(gòu)，其直徑大約相當(dāng)于細(xì)胞直徑的1/201/3。 微核率與用藥劑量或輻射積累效應(yīng)呈正相關(guān)。,實(shí)驗(yàn)材料：,毛蔥（Allium fistulosum）根尖。,實(shí)驗(yàn)器材：,顯微鏡，冰箱，水浴鍋，分析天平，剪刀，鑷子，刀片，載玻片，蓋玻片，濾紙，量筒，滴瓶，酒精燈，指管等。,試劑,環(huán)磷酰胺（CP） 卡諾氏（

7、Carnoys）固定液 希夫（Schiffs）試劑 45%醋酸 1 N鹽酸,實(shí)驗(yàn)步驟：,根尖的培養(yǎng),環(huán)磷酰胺處理,固定,解離,染色,壓片,鏡檢及觀察,實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備,臨時(shí)裝片制片,實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 誘變處理,毛蔥沙培生根，室溫下2-3天即長(zhǎng)出0.5 1cm長(zhǎng)的根； 置于環(huán)磷酰胺溶液中處理24小時(shí)； 從藥液中取出，水洗后清水培養(yǎng)24 小時(shí)； 水洗后用Carnoys固定液固定24小時(shí)，水洗，轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存。,臨時(shí)裝片制片 細(xì)胞學(xué)鑒定,解離：取70%乙醇中保存的根尖水洗兩次，用1N HCl 在60處理根尖8-10min后，水洗34次，每次5min。 染色：根尖在有蓋的小瓶中加入希夫（Schiff ）試劑染色30min2h。 壓片：在干凈的載玻片上切下根尖分生區(qū)，滴一滴45%醋酸，加蓋玻片，用濾紙吸凈多余的液體，一手壓住蓋玻片一角，另一手持竹針輕敲蓋玻片至組織呈云霧狀。將載玻片在酒精燈上輕烤，在蓋玻片上覆濾紙條，用拇指垂直按壓制片。 鏡檢及觀察。,結(jié)果及分析：,細(xì)胞學(xué)觀察： 在細(xì)胞分裂間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小在主核的1/3以下，折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣。,蠶豆根尖微核照片,2.微核率計(jì)算,微核率（MCN%o）= 微核數(shù)/細(xì)胞數(shù)1000%o,微核檢測(cè)記錄表,作業(yè)和思考題：,敘述微核形成原理。 統(tǒng)計(jì)微核細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核細(xì)胞千分率。