1、改變花色的轉(zhuǎn)基因矮牽?；?轉(zhuǎn)入熒光素酶蛋白基因的發(fā)熒光煙草,藍色玫瑰一直是人類美麗的夢想基因工程已將它變?yōu)楝F(xiàn)實,轉(zhuǎn) 基 因 西 紅 柿,由于細菌個體微小、遺傳物質(zhì)較為簡單，易于人工培養(yǎng)，繁殖速度快，突變型容易識別和檢出。因此，細菌一直被用做研究生物遺傳與變異規(guī)律的實驗材料。,利用人工誘變或雜交選育醫(yī)藥或食品工業(yè)中所需要的高產(chǎn)菌株。 利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建“基因工程菌”，生產(chǎn)新藥、疫苗、食品添加劑，或者用于環(huán)保等。,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)二、細菌的基因小胸泳衣突變?nèi)?、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組四、微生物基因組學(xué)五、基因工程菌株的構(gòu)建,細菌的遺傳與變異,1、細菌染色體基因組結(jié)構(gòu),細菌染色體是一個裸露的

2、閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，有核蛋白，缺乏組蛋白，無核膜包裹。,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),細菌基因組結(jié)構(gòu)的主要特征：,（1）遺傳信息是連續(xù)的，不含內(nèi)含子。很少有重復(fù)序列。,（2）通常，編碼相關(guān)功能的基因高度集中，組成操縱子（operon）結(jié)構(gòu)，自一個啟動子開始轉(zhuǎn)錄成多基因的mRNA分子，翻譯成多種功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),2、質(zhì)粒（plasmid）,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),是細菌染色體外的遺傳物質(zhì)，大多由閉合環(huán)狀雙鏈DNA組成。, 具有自我復(fù)制的能力。 所攜帶的基因賦予宿主菌某些生物學(xué) 性狀（如F質(zhì)粒、R質(zhì)粒、毒力質(zhì)粒、 代謝質(zhì)粒），增加小胸泳衣細菌的存活機會。 非生存所必需，可

3、自行丟失或消除。 可在細菌之間轉(zhuǎn)移。,質(zhì)粒DNA的特征,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),1)致育質(zhì)粒（F質(zhì)粒）與有性生殖功能關(guān)聯(lián)； 2)耐藥性質(zhì)粒 編碼細菌對抗菌藥物或重金屬鹽類的耐藥性。分兩類，一是接合性耐藥質(zhì)粒（R質(zhì)粒），另一是非接合耐藥性質(zhì)粒； 3)毒力質(zhì)粒（Vi質(zhì)粒） 編碼與該菌致病性有關(guān)的毒力因子； 4)細菌素質(zhì)粒 編碼細菌產(chǎn)生細菌素； 5)代謝質(zhì)粒 編碼產(chǎn)生相關(guān)的代謝酶。,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),3、轉(zhuǎn)座子（transposon）,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),是一個DNA片段（2kb），可在質(zhì)粒與質(zhì)粒之間或質(zhì)粒與染色體之間隨機轉(zhuǎn)移，故又稱為“跳躍基因” 。 轉(zhuǎn)座子不能自我復(fù)制。,轉(zhuǎn)座子,質(zhì)粒,

4、轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)特點, 2個末端反向重復(fù)序列：能為整合酶所識別，與插入功能有關(guān)。,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ), 中心序列：帶有遺傳信息，如常帶有耐藥基因、細菌毒素基因、整合酶（或轉(zhuǎn)座酶）基因。,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),當轉(zhuǎn)座子插入到某一基因組中，可能會產(chǎn)生什么遺傳學(xué)效應(yīng)？,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ), 可引起插入基因失活，產(chǎn)生基因突變。 在插入部位又出現(xiàn)一個或多個耐藥基因，使細菌產(chǎn)生耐藥性或多重耐藥性。,4、噬菌體（bacteriophage）,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。,轉(zhuǎn)座子,質(zhì)粒,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)二、細菌的基因突變?nèi)⒓毦幕蜣D(zhuǎn)移小胸泳衣與

5、重組四、微生物基因組學(xué)五、基因工程菌株的構(gòu)建,細菌的遺傳與變異,基因突變（gene mutation）：細菌染色體基因發(fā)生突然而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)改變，包括一對或少數(shù)幾對堿基的缺失、插入或置換（點突變：point mutation），導(dǎo)致細菌性狀的遺傳性變異。,1、概念,二、細菌的基因突變, 隨機發(fā)生，不定向 穩(wěn)定 自發(fā)突變產(chǎn)生頻率為10-1010-6 可誘發(fā)性：野生株、突變株,2、特點,二、細菌的基因突變, 耐藥性突變：選擇標記 毒力突變：疫苗研制、新現(xiàn)傳染病 營養(yǎng)缺陷體突變：新藥誘變作用檢測 高產(chǎn)突變：抗生素等藥品、食品生產(chǎn) 抗原性突變：逃逸免疫機制,3、突變現(xiàn)象,二、細菌的基因突變,日本發(fā)生過一

6、次細菌性痢疾大流行。從病人糞便中分離到大量的痢疾桿菌敏感株和耐藥株（同時耐鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、磺胺類），且大腸桿菌與痢疾桿菌有完全相同的多重耐藥性。多重耐藥性傳播迅速。耐藥菌在傳代、保藏過程中可自發(fā)失去耐藥性。 能否用基因突變解釋以上現(xiàn)象？,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)二、細菌的基因突變?nèi)?、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組四、微生物基因組學(xué)五、基因工程菌株的構(gòu)建,細菌的遺傳與變異,供體菌（donor）將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至受體菌（recipient），使后者獲得新的生物學(xué)性狀，稱為基因轉(zhuǎn)移（gene transfer）。 細菌通過水平方向的基因轉(zhuǎn)移和重組，產(chǎn)生新的基因型個體，以適應(yīng)隨時改

7、變的環(huán)境。,基因轉(zhuǎn)移的概念,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組, 質(zhì)粒（plasmid） 轉(zhuǎn)座子（transposon） 溫和噬菌體（temperate phage）,基因轉(zhuǎn)移的元件,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組, 接合（conjugation） 轉(zhuǎn)化（transformation） 轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction） 轉(zhuǎn)座（transposition）,基因轉(zhuǎn)移的方式,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,1、接合（conjugation）,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,接合：供體菌通過性菌毛與受體菌直接接觸，并將遺傳物質(zhì)（主要是質(zhì)粒DNA）轉(zhuǎn)移給受體菌，使受體菌獲得新的遺傳性狀。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,質(zhì)粒,質(zhì)粒接合

8、轉(zhuǎn)移示意圖,染色體,性菌毛,受體菌,供體菌,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,賦予宿主菌的耐藥性,編碼性菌毛，決定自主復(fù)制與接合轉(zhuǎn)移,耐藥性（R）質(zhì)粒,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,R質(zhì)粒主要以接合方式從耐藥菌傳遞給敏感菌，使后者變?yōu)槟退幘?R質(zhì)粒在同一種屬或不同種屬細菌之間傳遞，造成耐藥性的廣泛傳播，尤其在腸道桿菌中比較普遍，給臨床治療帶來很大困難 。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,日本發(fā)生過一次細菌性痢疾大流行。從病人糞便中分離到大量的痢疾桿菌敏感株和耐藥株（同時耐鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、磺胺類），且大腸桿菌與痢疾桿菌有完全相同的多重耐藥性。多重耐藥性傳播迅速。耐藥菌在傳代、保藏過程中可自發(fā)失去耐藥性。

9、 能否用基因突變解釋以上現(xiàn)象？,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,因子和接合,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,雄性菌株與雌性菌株接合結(jié)果,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,Griffith肺炎鏈球菌感染小鼠實驗（1928）,無莢膜活菌,有莢膜活菌,有莢膜死菌,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,有莢膜的活菌？,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,活的無莢膜肺炎鏈球菌從死的有莢膜肺炎鏈球菌中獲得莢膜（毒力決定因子）編碼基因，稱之為轉(zhuǎn)化（transformation）。 引起轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的物質(zhì)稱為轉(zhuǎn)化因子。,Avery研究揭示，轉(zhuǎn)化因子的本

10、質(zhì)是DNA，即遺傳物質(zhì)是DNA。1944年，獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,2、轉(zhuǎn)化（transformation）,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,轉(zhuǎn)化：受體菌從周圍環(huán)境中直接攝取供體菌游離的DNA片段，并整合入受體菌基因組中，從而獲得供體菌部分遺傳性狀的過程。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,（1）轉(zhuǎn)化的前提條件, 供體菌DNA片段的大小： 1020 個基因 供體DNA性質(zhì)：同源性高的、未變 性的雙鏈DNA；質(zhì)粒DNA。 受體菌的生理狀態(tài)：處于“感受態(tài)”,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,（2）自然轉(zhuǎn)化過程,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,1、受體菌處于感受態(tài)(competence) Ca2誘導(dǎo)

11、法、電穿孔法 受體細胞經(jīng)過一些特殊方法處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞。, 轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合與進入 雙鏈DNA與感受態(tài)受體菌表面的DNA結(jié)合受體結(jié)合。其中一條鏈被降解產(chǎn)生能量；另一條鏈與特異DNA結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，進入菌體內(nèi)。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組, 轉(zhuǎn)化因子的整合 單鏈DNA不經(jīng)復(fù)制，與受體菌同源DNA區(qū)段的單鏈配對，被取代的受體菌DNA單鏈被降解，最終產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,有莢膜的活菌？,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,3、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,以溫和噬菌體為媒介，將供體菌DNA片段（染

12、色體DNA、非接合性質(zhì)粒DNA）轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)，通 過基因重組而使受體 菌獲得新的遺傳性狀。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,（1）轉(zhuǎn)導(dǎo)的概念, 是感染細菌、放線菌、真菌等的病毒。 分為頭部和尾部。頭部由核心（核酸） 和衣殼（蛋白質(zhì)）構(gòu)成。 能通過細菌濾器。 須寄生在活的易感宿主 菌體內(nèi)。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,（2）噬菌體（phage）,（3）溫和噬菌體,烈（毒）性噬菌體（virulent phage）：噬菌體在宿主菌體內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生大量子代噬菌體，并最終裂解細菌，建立溶菌周期。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,溫和噬菌體（temperate phage）：感染宿主菌后，

13、不立即增殖，而是將其核酸整合到宿主菌染色體基因組中，與宿主菌DNA一起復(fù)制，并隨細菌的分裂而傳至子代細菌。,前噬菌體,溶原性細菌,有些溫和噬菌體可使溶原性細菌的表型發(fā)生相應(yīng)改變，稱之為溶原性轉(zhuǎn)換（lysogenic conversion）。例如，白喉棒狀桿菌若攜帶噬菌體時，可產(chǎn)生白喉毒素。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,溶原性細菌能正常以二分裂方式繁殖，前噬菌體也一代一代傳下去。但有時也會自發(fā)終止（發(fā)生率10-5），從染色體上脫落，進入溶菌周期。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,（4）轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制,前噬菌體從染色體上脫離進行增殖，裝配成新的子代噬菌體。大約在105107次裝配中發(fā)生一次錯誤，誤將大小合適的

14、供體菌DNA片段裝入噬菌體頭部，成為“假噬菌體”。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,假噬菌體,供體菌,當“假噬菌體”（轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）再度感染受體菌時，將供體菌DNA帶入受體菌內(nèi)。,完全轉(zhuǎn)導(dǎo)與流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo),普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,假噬菌體,受體菌,供體菌DNA,4、轉(zhuǎn)座（transposition）,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,轉(zhuǎn)座子在質(zhì)粒之間或質(zhì)粒與染色體之間的自行轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，稱之為轉(zhuǎn)座 。,轉(zhuǎn)座子能在2個沒有任何同源性的基因組之間轉(zhuǎn)座（即插入到某一基因），并能引起一系列遺傳效應(yīng)。 可引起插入基因失活，產(chǎn)生基因突變。 在插入部位引入一個或多個新的基因 （如耐藥基因、毒素基因。,三、細

15、菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,轉(zhuǎn)座子的自行轉(zhuǎn)移不需要核苷酸堿基對同源才能插入，可在革蘭陰性菌和革蘭陽性菌之間轉(zhuǎn)移。,三、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)二、細菌的基因突變?nèi)⒓毦幕蜣D(zhuǎn)移與重組四、微生物基因組學(xué)五、基因工程菌株的構(gòu)建,細菌的遺傳與變異,微生物基因組學(xué)（Genomics）是利用全基因組DNA序列研究微生物基因及其功能的學(xué)科。,四、微生物基因組學(xué),細菌是研究和分析基因組序列與相關(guān)生物學(xué)功能關(guān)系的理想模式。,首先，用超聲波將細菌染色體DNA隨機切割成一定大小的DNA片段，插入到測序載體（質(zhì)粒）中，以構(gòu)建DNA文庫，進行大規(guī)模的測序，對DNA序列加以拼接。,1、核苷酸序列測定,四、

16、微生物基因組學(xué),經(jīng)過計算機分析，完成全基因組各個區(qū)域的編號和注釋，最后存入數(shù)據(jù)庫，并在互聯(lián)網(wǎng)上發(fā)表，以供全世界的科學(xué)家參考和使用。,四、微生物基因組學(xué),細菌全基因組序列測定完成后，更重要的任務(wù)是鑒定基因及盡可能確定基因的功能，稱之為后基因組學(xué)。,2、微生物基因組結(jié)構(gòu)與功能研究,四、微生物基因組學(xué),3、微生物基因組學(xué)研究的意義,四、微生物基因組學(xué),根據(jù)病原菌全基因組序列，應(yīng)用現(xiàn)代生物信息軟件對基因序列進行分析，可確定哪些基因與毒力、體內(nèi)定居或體內(nèi)持續(xù)感染有關(guān)，從而闡明病原菌致病基因及其產(chǎn)物。,（1）揭示病原微生物的致病機制,四、微生物基因組學(xué),從分子和細胞水平上，揭示微生物與宿主之間的相互作用，

17、更深入地闡明病原微生物的致病機制，諸如毒素作用機制、宿主細胞中微生物的受體，侵入細胞內(nèi)微生物的定位和新表位的發(fā)現(xiàn)，對宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)等。,四、微生物基因組學(xué),（2）建立靈敏特異的基因診斷技術(shù),傳統(tǒng)的病原體診斷依賴于致病微生物的形態(tài)、培養(yǎng)和生化特征。 通過測定多種致病與非致病微生物的基因組序列，可以獲得大量的基因信息。如特異DNA序列用于診斷，菌株特異性基因用于分型。,四、微生物基因組學(xué),圖2 引物特異性單重PCR電泳結(jié)果 m 100bp Marker， 1 CMCC51252, 2 CMCC51572, 3 CMCC51592, 4 GIM-Shi1, 5 GIM-Shi2, 6 ATCC9

18、027, 7 ATCC15442, 8 CMCC10104, 9 GIM-Ps, 10 ATCC43889, 11 GDCIQ-O157-1, 12 GDCIQ-O157-2, 13 CMCC50093, 14 CMCC50071, 15 CMCC50115, 16 CMCC47001, 17 GIM-Vp, 18 GDCIQ-Vp,（3）開發(fā)新型抗菌藥物,病原菌全基因組序列的測定，一方面，能揭示細菌耐藥的確切機制，對現(xiàn)有抗菌藥物進行改造或開發(fā)新型藥物。,四、微生物基因組學(xué),另一方面，可使藥物的研發(fā)策略從篩選化合物庫轉(zhuǎn)向優(yōu)先篩選靶位基因，即以病原菌為目標，找出在人類基因組中缺失，對耐藥菌生存必

19、不可少并在感染過程中優(yōu)先表達的基因；選擇這些基因作為抗菌藥物的靶位點，可設(shè)計出具有針對性很強的藥物（窄譜抗生素）。,四、微生物基因組學(xué),病原菌全基因組序列的測定，還可大大加速新疫苗的研制。,（4）開發(fā)新型疫苗,四、微生物基因組學(xué),通過生物信息學(xué)軟件，對全基因組序列進行分析，可預(yù)測出病原體的具有很高免疫原性的保護性抗原及其表位。 將抗原或表位編碼基因在合適的載體系統(tǒng)中表達，分離純化目的抗原或表位。最后，檢測抗原的安全性和有效性。,四、微生物基因組學(xué),隨著微生物基因組被解碼和微生物功能基因組的研究與開發(fā)，微生物學(xué)正面臨著革命性的飛躍。微生物基因組研究所獲得的信息將迅速轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，微生物感染性疾病

20、的診、防、治，將會徹底得到改觀。,四、微生物基因組學(xué),一、細菌遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)二、細菌的基因突變?nèi)?、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組四、微生物基因組學(xué)五、基因工程菌株的構(gòu)建,細菌的遺傳與變異,目的基因,重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化,目的蛋白,五、基因工程菌株的構(gòu)建,重組DNA技術(shù),基因工程菌,五、基因工程菌株的構(gòu)建,質(zhì)粒作為一種獨立的復(fù)制子，容易從細胞中分離出來、在體外進行遺傳操作和轉(zhuǎn)入到合適的受體細胞中，表達外源目的基因。 自主復(fù)制，可表達外源基因 限制性酶切位點 選擇性標記（耐藥性）,五、基因工程菌株的構(gòu)建,質(zhì)?？勺鳛楸磉_載體，首先在體外構(gòu)建重組質(zhì)粒（攜帶目的基因）；再轉(zhuǎn)入原核表達系統(tǒng)（大腸桿菌）或真核表達系統(tǒng)（酵母菌）中，構(gòu)建“基因工程菌株”；大量表達目的基因，獲得目的蛋白（如氨基酸、味精、抗生素、胰島素、干擾素、生長激素、乙肝疫苗）。,五、基因工程菌株的構(gòu)建,幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的致病菌，并與胃腺癌和胃部淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。,立論依據(jù),五、基因工程菌株的構(gòu)建,我國人口Hp感染率為70%。目前主要采用的抗生素療法（三聯(lián)藥物:埃索美拉唑阿莫西林克拉霉素 ）的療效不甚理想，易復(fù)發(fā)。 疫苗被認為是控制Hp感染最有效的方法。,五、基因工程菌株的構(gòu)建, 全菌滅活疫苗 亞單位疫苗 由于以上疫苗各自的缺