1、HIV檢測(cè)及臨床意義,中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院 艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室 尚 紅,1,HIV的發(fā)現(xiàn),Montagnie (LAS) 1983. Science 220: 868-871 Gallo (HTLV) 1983. Science 220: 865-86 Levy (ARV) 1984. Science 225: 840-842 1986 國(guó)際病毒分類委員會(huì)： HIV HIV-2 1986 西非,2,中國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)的HIV/AIDS病例數(shù)（19852002）,3,HIV感染可通過(guò)兩種途徑檢測(cè),直接檢測(cè)病毒或其組成部分 檢測(cè)人體HIV免疫反應(yīng)HIV特異性抗體 從感染到血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)有一段窗口期，平均為

2、1-3個(gè)月，有一小部分HIV感染者出現(xiàn)延遲反應(yīng),4,HIV感染后抗原和抗體的變化及其與疾病關(guān)系,HIV感染人體后出現(xiàn)一過(guò)性病毒血癥，6-8周后血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，病毒滴度降低，在隨后的5-8年無(wú)癥狀帶毒期里HIV抗體一直存在，但病毒難查到。進(jìn)入AIDS期后血漿中病毒再次出現(xiàn)。 故診斷HIV感染多數(shù)時(shí)間用抗體檢測(cè)診斷，極早期（窗口期）用抗原檢測(cè)。,5,HIV抗體診斷,目前臨床上實(shí)際應(yīng)用的是測(cè)定特異性HIV抗體，包括初篩和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。,6,一、檢測(cè)試劑,篩查試劑必須是HIV-1/2混合型、經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)、批批檢合格、臨床評(píng)估質(zhì)量?jī)?yōu)良、在有效期內(nèi)的試劑。 目前常用的篩查試劑有酶聯(lián)免疫、顆粒凝集

3、和其它快速診斷試劑。采供血機(jī)構(gòu)進(jìn)行血液篩查應(yīng)采用酶聯(lián)免疫試劑。 自采自供血的單位必須進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)，在尚未建立艾滋病篩查實(shí)驗(yàn)室的偏遠(yuǎn)地區(qū)可由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的技術(shù)人員在規(guī)定的場(chǎng)所用快速試劑進(jìn)行血液篩查。,7,2、確認(rèn)試劑必須經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)。確認(rèn)試劑包括免疫印跡試驗(yàn)、條帶免疫試驗(yàn)及免疫熒光試驗(yàn)試劑。目前以免疫印跡試劑最為常用。,8,ELISA方法： 目前最常用的初篩實(shí)驗(yàn)，自1985年首次檢測(cè)HIV-1抗體的試劑盒供市以來(lái)，已從第一代的全病毒抗原間接法發(fā)展到第四代的以重組的多肽抗原及抗P24抗體包被的雙夾心法，使窗口期縮短了2-3周。,9,四代艾滋病酶聯(lián)免疫試劑比較,第四代,病毒裂解液

4、重組抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 Ab,IgM / IgG 抗體 HIV-1 / -2 / -O p24 抗原,病毒裂解液 重組抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 抗體,10,Closing the window,第一代試劑檢測(cè)IgG抗體，第三代試劑檢測(cè)IgG 、IgM抗體, 第四代試劑同時(shí)檢測(cè)IgG、 IgM抗體和P24抗原使窗口期縮短。,11,檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告和處理 陰性反應(yīng)出具HIV抗體陰性報(bào)告， 如果近期有高危行為，如性亂、注射毒品等，或有急性流感樣癥狀等情況，為排除“窗口期”的可能，可以進(jìn)行HIV-1 P24抗原或HIV核酸檢測(cè)

5、，或23個(gè)月以后再做抗體檢測(cè)。 篩查實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)反應(yīng)，可出具“HIV抗體待復(fù)查”的報(bào)告，不能出陽(yáng)性報(bào)告。,12,HIV抗體初篩檢測(cè)流程圖,13,快速診斷試劑： 采用乳膠凝集、免疫斑點(diǎn)和免疫層析三種原理 快速、不需特殊儀器 敏感度、特異度低于ELISA，且價(jià)格貴 適用于血站覆蓋不到的邊遠(yuǎn)地區(qū)/城市大醫(yī)院急診手術(shù)前檢查 快速診斷陽(yáng)性結(jié)果還需經(jīng)ELISA方法驗(yàn)證,14,HIV抗體確認(rèn),常用的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方法是免疫印跡法（WB）。 免疫印跡試劑有HIV-1/2混合型和單一型。一般先用HIV-1/2混合型試劑進(jìn)行檢測(cè),15,蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB） 廣泛使用的確認(rèn)實(shí)驗(yàn) 用聚丙烯酰胺凝膠電泳將純化的HIV蛋白抗

6、原分開后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。標(biāo)本中存在的HIV抗體與條帶上的抗原結(jié)合，再加入酶偶聯(lián)的抗人IgG抗體和底物，在抗原抗體結(jié)合的部位會(huì)出現(xiàn)有色條帶 其可檢測(cè)標(biāo)本中針對(duì)HIV不同抗原的抗體，故被用做確認(rèn)試劑。 不同的研究機(jī)構(gòu)有不同的判定標(biāo)準(zhǔn),16,WB結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),“不確定”()：出現(xiàn)HIV-1特異性條帶，但帶型不足以 確認(rèn)陽(yáng)性，每三個(gè)月隨訪一次，共兩次， 仍屬可疑，判為陰性,17,18,HIV抗體確認(rèn)檢測(cè)流程圖,免疫印跡法(HIV1/2混合型),HIV-1陽(yáng)性反應(yīng),可疑反應(yīng),出現(xiàn)HIV-2指帶,HIV-1陽(yáng)性報(bào)告,可疑反應(yīng),陽(yáng)性反應(yīng),陰性反應(yīng),報(bào)告HIV-2血清學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)報(bào)告必要時(shí)測(cè)核酸,陰性報(bào)告,

7、免疫印跡法（HIV-2）,每3個(gè)月隨訪一次，共2次，仍屬可疑，則作陰性報(bào)告如隨訪期間出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)則報(bào)告陽(yáng)性,陰性反應(yīng),陰性報(bào)告,19,P24抗原測(cè)定 （一）適用范圍,HIV-1抗體不確定或窗口期的輔助診斷。 HIV-1陽(yáng)性母親所生嬰兒的鑒別診斷。 第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)， 但HIV-1抗體確認(rèn)陰性者的診斷。 監(jiān)測(cè)病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。,20,（三）結(jié)果報(bào)告和解釋,1、HIV-1 P24抗原的陽(yáng)性結(jié)果必須經(jīng)過(guò)中和試驗(yàn)確認(rèn)。 2、HIV-1 P24抗原陽(yáng)性僅作為HIV感染的輔助診斷依據(jù)，不能依此確診。 3、HIV-1 P24抗原陰性結(jié)果只表示在本試驗(yàn)中無(wú)反應(yīng)，不

8、能排除HIV感染。,21,HIV核酸檢測(cè),22,1、輔助診斷 某些非典型的抗體反應(yīng)，特別是不確定反應(yīng)時(shí)，RNA的測(cè)定可提供非常有用的證據(jù)。 單純使用RNA測(cè)定不能完全確定感染與否，但當(dāng)RNA測(cè)定出現(xiàn)較高拷貝數(shù)的陽(yáng)性結(jié)果時(shí)（1000）提示感染發(fā)生的可能性非常大。 使用此指標(biāo)應(yīng)綜合其他檢測(cè)數(shù)據(jù)和樣品背景情況進(jìn)行綜合分析與判斷。,23,2、窗口期輔助診斷,在窗口期抗原峰出現(xiàn)前后通常出現(xiàn)一個(gè)病毒載量的高峰，通常此高峰高于發(fā)病時(shí)的血漿病毒水平，早期病毒RNA測(cè)定具有特殊的意義。 目前國(guó)際上正在嘗試使用這種檢測(cè)對(duì)采供血樣品進(jìn)行多個(gè)樣品混合后的RNA檢測(cè)以降低窗口期傳播的殘余危險(xiǎn)度。,24,3、病程監(jiān)控,由

9、于HIV感染發(fā)生后病毒載量的變化具有一定規(guī)律，并且這種變化與疾病的進(jìn)程有著密切的相關(guān)性。 通常在感染后無(wú)癥狀期內(nèi)發(fā)生的臨床癥狀很難與AIDS發(fā)病時(shí)的癥狀區(qū)別，病毒載量測(cè)定可以幫助醫(yī)生判斷一個(gè)剛發(fā)生的癥狀是否與HIV感染有關(guān)。,25,4、指導(dǎo)治療方案及療效測(cè)定,并非在任何情況下感染者都應(yīng)該進(jìn)行抗病毒治療，這不但是經(jīng)濟(jì)上的原因，更重要的是在于抗病毒藥物的副作用和療效。通常在病毒載量達(dá)到一定水平后（如35000-50000拷貝/毫升）才具有良好的效果。 只有通過(guò)治療后病毒水平的檢測(cè)才能確定治療是否有效，通常治療后病毒水平降低50%才被認(rèn)為臨床有效。,通過(guò)監(jiān)測(cè)病毒滴度反映療效,26,5、預(yù)測(cè)疾病進(jìn)程,

10、HIV疾病進(jìn)程與病毒載量的關(guān)系十分密切，觀察感染者病毒RNA水平可大致預(yù)測(cè)其發(fā)病的可能。如右圖所示，病毒載量與6年發(fā)病率的關(guān)系為： 30000時(shí)則為80%。,27,定性檢測(cè),HIV核酸檢測(cè)有定性和定量?jī)深?，定性檢測(cè)用于HIV感染的輔助診斷。通常使用PCR或RT-PCR技術(shù)，使用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室通用的擴(kuò)增試劑，引物可來(lái)自文獻(xiàn)或自行設(shè)計(jì)，應(yīng)盡量涵蓋所有的或常見的毒株，也可使用復(fù)合引物。,28,定量檢測(cè),定量檢測(cè)常用于監(jiān)測(cè)HIV感染者的病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。目前常用的HIV RNA定量測(cè)定方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)（RT-PCR）、核酸序列擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)（NASBA）、分支DNA雜交實(shí)驗(yàn)（bDNA）等，這

11、幾種進(jìn)口試劑盒的最低檢測(cè)限為20-50拷貝/毫升 按照儀器讀數(shù)報(bào)告結(jié)果，應(yīng)注明使用的試驗(yàn)方法、樣品種類和樣品量。 測(cè)定結(jié)果小于最低檢測(cè)限時(shí)，應(yīng)注明最低檢測(cè)限水平。注意低于最低檢測(cè)限的結(jié)果不能排除HIV感染。 應(yīng)附上儀器打印的數(shù)據(jù)。,29,各種HIV定量檢測(cè)方法的比較,30,關(guān)于不同HIV定量檢測(cè)方法的選擇,目前用于統(tǒng)一不同定量方法檢測(cè)值的標(biāo)準(zhǔn)品還沒有問(wèn)世 不同定量方法結(jié)果之間還無(wú)法直接比較 同一病人治療前后建議用同一方法進(jìn)行HIV定量檢測(cè),31,艾滋病免疫指標(biāo)的檢測(cè),32,隨著政府加速對(duì)國(guó)產(chǎn)抗艾滋病藥物上市的批準(zhǔn)，我國(guó)艾滋病人的治療已經(jīng)出現(xiàn)了曙光。 艾滋病臨床治療中各種免疫指標(biāo)(CD4+、CD

12、8+T細(xì)胞 等)對(duì)于確定感染狀態(tài)、預(yù)測(cè)發(fā)病、評(píng)價(jià)藥物療效及新藥開發(fā)具有重要的作用。,33,CD4 T淋巴細(xì)胞：（流式細(xì)胞術(shù)） CD4 T細(xì)胞是HIV的主要靶細(xì)胞,感染后隨著病程進(jìn)展，CD4 T細(xì)胞不斷下降 500/mm3有臨床診斷意義 200/mm3AIDS CDC 病程進(jìn)展， AIDS診斷和療效觀察的指標(biāo),34,HIV感染幾周內(nèi)，出現(xiàn)類流感癥狀，也稱為血清陽(yáng)轉(zhuǎn)期， CD4細(xì)胞的數(shù)量降低。隨之出現(xiàn)的免疫應(yīng)答可以控制急性癥狀，恢復(fù)CD4細(xì)胞的數(shù)量，但并不能清除病毒。隨著CD4細(xì)胞不斷下降，當(dāng)降至500/ul左右時(shí)，開始出現(xiàn)機(jī)會(huì)性感染或其它疾病，進(jìn)入癥狀期。當(dāng)CD4低于200/ul時(shí)，即進(jìn)入艾滋病

13、期。,35,CD4+T淋巴細(xì)胞小于350/ul（結(jié)合病毒載量，確定治療時(shí)機(jī)）,有效,HIV感染,36,病毒變異和耐藥性的測(cè)定,隨著HAART治療的廣泛開展，病毒變異和耐藥株正在不斷出現(xiàn)，甚至對(duì)一個(gè)藥物的耐藥可引起多種藥物的交叉耐藥。 因此近年來(lái)各國(guó)相繼建立起病毒變異和耐藥的測(cè)試方法，包括基因型HIV耐藥測(cè)試和表型HIV耐藥測(cè)試。,37,表型HIV耐藥性測(cè)試方法,能直接測(cè)出HIV-1對(duì)藥物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐藥情況，有利于指導(dǎo)HIV-1感染者有效地用藥。 目前市面上供應(yīng)試劑盒已有2種，即AV（Vicro Antivirogram）和PS（Virologic PhenoSense），兩者方法均應(yīng)用從生長(zhǎng)于載體中的HIV-1而獲得的重組病毒和病人標(biāo)本中蛋白酶與逆轉(zhuǎn)錄酶序列，分析與野病毒之間IC50值相差倍數(shù)，一般達(dá)510倍以上為陽(yáng)性。 這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得各種藥物耐藥量度數(shù)據(jù)，但不足的是試驗(yàn)慢又昂貴，技術(shù)要求高。,38,基因型