1、鱸魚病毒性疾病病原體的檢測與鑒定,淡水鱸魚具有生長快、適應(yīng)性廣、抗病能力強、肉質(zhì)鮮美等特點，深受人們歡迎。我國沿海均有分布，資源豐富，雖然，鱸魚抗病能力較強，自然條件下不易患病。但人工高密度養(yǎng)殖因其生存環(huán)境及空間發(fā)生很大變化，稍有不慎極易造成疾病，尤其是病毒性疾病，危害極大。,鱸魚?；嫉牟《拘约膊∮校?鱸魚淋巴囊腫病 鱸魚病毒性出血性敗血癥 鱸魚病毒性腦壞死疾病,魚類淋巴囊腫病是由淋巴囊腫病毒感染引起魚類的一種典型的皮膚和淺表組織慢性病,它是最早發(fā)現(xiàn)的魚類病毒性疾病。 該病的普遍癥狀是病魚體表長有瘤狀物,嚴重時內(nèi)臟組織器官也出現(xiàn)病變。 所以以鱸魚淋巴囊腫病為例設(shè)計實驗證明這一病毒為這一病害的病

2、原體。,鱸魚淋巴囊腫病病狀： 病魚眼睛、口腔內(nèi)外、鰓及上下體表各部位有大小不一的囊腫物，囊腫物小如念珠，大如菜花，顏色有白色、粉紅色和黑色，較大的囊腫物上有肉眼可見的紅色小血管。患病嚴重的，囊腫物遍布體表，當(dāng)囊腫物破裂時，會形成開放性潰面。鱸魚輕微發(fā)病時，攝食正常、但生長緩慢；疾病嚴重時，病魚基本不攝食、部分死亡 。,檢測方法,顯微和超微觀察 核酸擴增技術(shù) 免疫檢測,顯微和超微觀察,顯微鏡和生物電鏡技術(shù)是研究病毒感染引起的的病理變化，觀察病毒和細胞超微結(jié)構(gòu)，揭示病毒與宿主細胞相互作用的技術(shù)。通過電子顯微鏡可以觀察病變細胞的病理結(jié)構(gòu)、病毒形態(tài)大小和類型以及了解病毒的感染、復(fù)制和形態(tài)發(fā)生等特征。,

3、檢測步驟,收集病體魚與健康魚的細胞或組織樣品 （主要靶器官魚體表皮下結(jié)締組織、其次是鰓、體腔膜、腸、脾和頭腎） 制備石蠟切片、冷凍切片或半薄切片 經(jīng)熒光染料染色 觀察并與健康魚同區(qū)域細胞做對比,觀察到的癥狀,在體表皮下結(jié)締組織中，當(dāng)大量成纖維細胞膨大、變圓，大小為1018m時，細胞膜外未出現(xiàn)囊壁，少數(shù)細胞的細胞質(zhì)中觀察到嗜堿性物質(zhì)（堿性物質(zhì)通常是指具有提供電子的能力或接受質(zhì)子的能力的物質(zhì)。）；1820m的膨大細胞在細胞膜外出現(xiàn)囊壁，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜堿性物質(zhì)；大于20m的細胞具有了淋巴囊腫細胞的典型特征。另外，在鱸魚的鰓等部位均觀察到淋巴囊腫細胞，并在鱸魚脾內(nèi)觀察到膨大細胞。,顯微和超微觀察,返回

4、,核酸擴增技術(shù),核酸雜交技術(shù)是一種分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用于檢測DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）。PCR技術(shù)具有特異、敏感、高效、快速、簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點。PCR由變性退火延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。目的是：在試管中將所要研究的鱸魚病變組織的基因或DNA片段在數(shù)小時內(nèi)擴增足量的DNA，再進行分析研究和檢測鑒定。目前已成功進行了魚類細胞淋巴囊腫病毒的檢測。,返回,間接熒光法,該方法分為兩步：獲取單克隆抗體、間接熒光法的檢測和鑒定 獲取單克隆抗體的步驟： （1）抗原制備 1.取病體魚的病變細胞或組織 2.將樣品制成組織勻漿，反復(fù)凍融三次，選擇適當(dāng)轉(zhuǎn)速進行差速離心 或密度梯度離心的方法進行純化 3.進行滅活處理 （2）將待測抗原注射到小鼠體內(nèi)（免疫動物）； （3）免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備、細胞融合； （5）雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)、篩選； （7）雜交瘤細胞的克隆化及單克隆抗體的大量制備。,間接法（又稱熒光抗體法）的步驟 （1）制作病體魚的組織切片并固定 （2）第一步，用已知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原（待檢 標(biāo)本）標(biāo)本上，在濕盒中37保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合。洗 滌，除去未結(jié)合的抗體。 （3）加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM 抗體