1、1,CHAPTER 2,Experimental Approaches for Studying Cells,2,OUTLINE,2.1 TECHNIQUES OF MICROSCOPY 2.2 TECHNIQUES OF CYTOCHEMISTRY 2.3 TECHNIQUES OF CELL SORTING 2.4 CELL ENGINEERING 2.5 TECHNIQUES OF ISOLATION 2.6 METHODS OF MOLECULAR BIOLOGY,3,普通光學(xué)顯微鏡,4,2.1 TECHNIQUES OF MICROSCOPY,2.1.1 The Light Micr

2、oscope Resolving power,R 顯微鏡的數(shù)值孔徑 (numeric aperture，NA) 放大率(magnification,M),5,波長(zhǎng)與分辨率,6,2.1.2 光鏡標(biāo)本制備技術(shù) 細(xì)胞染色技術(shù) 組織固定和切片技術(shù) 細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 利用 Feulgen反應(yīng)可特異性檢測(cè) 細(xì)胞中DNA。,7,2.1.3 常用光學(xué)顯微鏡 普通雙筒顯微鏡 (binoular microscope) 熒光顯微鏡 (fluorescence microscope) 相差顯微鏡 (phase contrast microscope),8,2.1.3 常用光學(xué)顯微鏡 倒置顯微鏡 物鏡與照明系統(tǒng)的位置顛倒

3、。 集光器與載物臺(tái)之間的工作距離提高,可以放置培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等容器,直接對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行照明和觀察。,9,倒置顯微鏡,10,2.2 電子顯微鏡 (Electron microscope),1932年德國學(xué)者M(jìn)ax Knolls和Ernst Ruska用波長(zhǎng)比光短得多的電子作光源,發(fā)明了第一臺(tái)電子顯微鏡，大大提高了顯微鏡的分辨率，開拓了超微世界。,11,2.2.1 電子顯微鏡概述 電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu) 電子顯微鏡基本結(jié)構(gòu)由三大部分組成: 電子光學(xué)系統(tǒng)由照明系統(tǒng)、標(biāo)本室、 成像系統(tǒng)、觀察窗和記錄用的照相機(jī)等 組成； 真空系統(tǒng)是保持電鏡的真空度； 電子學(xué)系統(tǒng)即供電系統(tǒng)，需要高壓穩(wěn)壓。,12,透射電子

4、顯微鏡,13,電子染色,標(biāo)本對(duì)電子的散射能力取決于其組成 元素的原子序數(shù),原子序數(shù)越高,散射的電 子越多,反差就越大。生物分子是由一些原 子序數(shù)很低的輕元素(氫、氧、碳、氮等) 組成的,它們散射電子的能力很弱,在電鏡 下幾乎不存在明暗反差。為使生物樣品加 大反差,就要進(jìn)行染色,即用重金屬增加電 子散射能力,稱為電子染色。,14,電鏡樣品的制備,15,2.2.2 Transmission Electron Microscope 冰凍蝕刻術(shù)(freeze-etching) 是專門觀察樣品外表面的投影 復(fù)型術(shù)。,16,冰凍蝕刻技術(shù),17,2.2.3 Scanning Electron Microsc

5、ope 原理： 目前一般掃描電鏡的分辨率約60100 (610nm)。,18,掃描電鏡,19,2.2.4 Scanning Tunneling Microscope,STM 基本原理,20,掃描隧道顯微鏡工作原理,21,2.2.4 掃描隧道顯微鏡 掃描隧道顯微術(shù)在生命科學(xué) 中的應(yīng)用 DNA結(jié)構(gòu)研究； 膠原、纖維和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究； 細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)的研究。,22,掃描隧道電鏡下的DNA雙螺旋,23,2.3 TECHNIQUES OF CYTOCHEMISTRY,2.3.1 酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)就是通過酶的特異細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)來顯示酶在細(xì)胞內(nèi)的定位。 2.3.2 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 免疫熒光技術(shù)

6、 免疫電鏡技術(shù),24,2.4 Radioautography,放射自顯影的原理是利用放射性同位素所發(fā)射出來的帶電離子(或離子)作用于感光材料的鹵化銀晶體,從而產(chǎn)生潛影。這種潛影可用顯影液顯示,成為可見的“像”。因此,它是利用鹵化銀乳膠現(xiàn)象,檢查和測(cè)量放射性的一種方法。,25,放射自顯影術(shù),26,2.5 分析細(xì)胞學(xué)技術(shù),2.5.1 流式細(xì)胞術(shù) (Flow cytometry) 流式細(xì)胞器 (Flow cytometer,FCM),27,流式細(xì)胞術(shù),28,細(xì)胞分選,29,細(xì)胞標(biāo)記,30,染色體分選,31,染色體標(biāo)記,32,2.6 細(xì)胞工程技術(shù)(Cell Engineering),2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) 體外細(xì)胞培養(yǎng)的條件 無血清培養(yǎng) 環(huán)境因素 無菌環(huán)境、合適的溫度、一定的滲透 壓和氣體環(huán)境、O2和CO2。后者對(duì)于維 持細(xì)胞培養(yǎng)液的酸堿度十分重要。 代謝物和廢物排除：,33,Knockout Mice,The technique used to generate knockout mice was developed in the late 1980s by Marlo Capecchi at the University o