1、項(xiàng)目2：微生物發(fā)酵技術(shù) 任務(wù)2：工業(yè)培養(yǎng)基制備與滅菌,教學(xué)安排： 1. 員工培訓(xùn) 由老師講解工業(yè)培養(yǎng)基理論基礎(chǔ)。 分配實(shí)操任務(wù)：工業(yè)培養(yǎng)基的制備與滅菌。,2. 學(xué)生模擬組建運(yùn)營一個培養(yǎng)基車間，撰寫計(jì)劃書(在理論教學(xué)期間完成)。 市場部：當(dāng)前工業(yè)培養(yǎng)基的發(fā)展特點(diǎn)，培養(yǎng)基滅菌方法的技術(shù)進(jìn)展。 技術(shù)部：確定工業(yè)培養(yǎng)基制備的技術(shù)路線，撰寫操作規(guī)程。 品控部：制定工業(yè)培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法。 總經(jīng)理：協(xié)調(diào)監(jiān)督各部工作，最后拿出完整的計(jì)劃書。,3. 計(jì)劃書實(shí)施。 計(jì)劃書要先經(jīng)過老師的審核，然后實(shí)施。 實(shí)施過程中考核操作技能。 實(shí)施后及時進(jìn)行實(shí)訓(xùn)報告的撰寫也總結(jié)。,一 培養(yǎng)基組成 1 培養(yǎng)基配方組成：組成

2、成分、各組成成分的濃度、合適的pH； 2 培養(yǎng)基隨微生物的生理與產(chǎn)物不同而不同； 3 培養(yǎng)基成分： (1)碳源：葡萄糖、淀粉； (2)氮源：碳酸銨、玉米漿；,第一節(jié) 概述,(3)無機(jī)鹽和微量元素； (4)前體和誘導(dǎo)物。 二 培養(yǎng)基組成影響細(xì)胞分化和產(chǎn)物形成 細(xì)胞分化：細(xì)胞形態(tài)、生理功能和化學(xué)組成上彼此不同； 培養(yǎng)基組成影響細(xì)胞分化： 二價陽離子、陰離子聚合物、表面活性劑、固形物含量、各成分的濃度、培養(yǎng)液的pH。,例： 在堿性培養(yǎng)基中產(chǎn)黃青霉易形成球狀體； 二價陽離子誘發(fā)細(xì)胞呈球形； 無素錳可通過改變黑曲霉菌細(xì)胞壁的成分； 生物素和青霉素能改變細(xì)胞膜的成分。,三 配制工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的一般要求 (

3、1)組成豐富，濃度適當(dāng)； (2)各成分之間彼此不反應(yīng)； (3)粘度適當(dāng)，具有適當(dāng)?shù)臐B透壓； (4)成分要有利于主產(chǎn)物的合成，不利于副產(chǎn)物的合成； (5)即不影響通氣與攪拌，又不影響或稍微影響產(chǎn)物的分離精制和廢物處理； (6)因地制宜，質(zhì)優(yōu)價廉，成本低。,第二節(jié) 培養(yǎng)基的成分,一 碳源 碳源：構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物； 能源。 (一)糖類 單糖、雙糖、多糖、淀粉質(zhì)類和糖蜜； (二)脂肪 利用油脂增加微生物需氧量，產(chǎn)酸，降pH；要注意貯藏油脂，防止產(chǎn)生過氧化物。,(三)有機(jī)酸和醇； (四)碳?xì)浠衔铮?二 氮源 構(gòu)成細(xì)胞成分，亦可作碳源使用。 (一)無機(jī)氮源的特點(diǎn) 1 成分單一，質(zhì)量較穩(wěn)定； 2

4、易被菌體吸收利用； 3 改變培養(yǎng)液的pH。 生理酸性物質(zhì)與生理堿性物質(zhì)。,(二)有機(jī)氮源的特點(diǎn) 1 成分比較復(fù)雜； 2 被菌體利用的速度不同； 速效氮源：玉米漿； 遲效氮源：黃豆餅粉和花生餅粉。 3 微生物對氨基酸的利用有選擇性； 部分氨基酸即可用于菌體生長，亦可用于次級代謝產(chǎn)物的合成。 4 是引起發(fā)酵水平波動的主要因素。 常用有機(jī)氮源：黃豆餅粉、棉籽餅粉、麩質(zhì)粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉等。,三 無機(jī)鹽和微量元素 許多金屬離子低濃度呈刺激作用，高濃度呈抑制作用。 1 磷 (1)組成生物大分子：核酸、核蛋白； (2)作為緩沖液調(diào)節(jié)pH； (3)對某些次級代謝產(chǎn)物有抑制作用。 常用磷酸鹽：磷酸二氫鉀

5、、磷酸氫二鉀及其鈉鹽。,2 硫 構(gòu)成細(xì)胞生物分子。 常用化合物：硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨、硫代硫酸鈉。 3 鐵 是細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化酶的組成元素，同時對許多產(chǎn)物合成有抑制作用。 常用化合物：硫酸鐵。,4 鋅、鎂、鈷 鋅對部分抗生素合成有促進(jìn)作用及操作菌體生長，過量則抑制。常用化合物：硫酸鋅； 鎂激活一些酶，能提高一些菌體對本身所產(chǎn)抗生素的耐受性。常用化合物：硫酸鎂； 鈷是維生素B12的元素之一。常用化合物：氯化鈷。,5 鈉、鉀、鈣 鈉：細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞滲透壓； 鉀：影響細(xì)胞膜透性； 鈣：調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性，控制pH。 四 水 功能： (1)溶劑與運(yùn)輸介質(zhì)； (2)參與生化反應(yīng)； (3)維持

6、生物大分子穩(wěn)定性；,(4)傳遞熱； (5)維持細(xì)胞形態(tài)； (6)控制酶的活性。 水的活度。 五 前體 在產(chǎn)物的生物合成過程，被菌體用于產(chǎn)物合成而自身結(jié)構(gòu)無顯著改變的物質(zhì)。 內(nèi)源性前體和外源性前體。,六 消泡劑 植物油、動物油和一些化學(xué)合成的高分子化合物。 七 其他成分 生長因子與誘導(dǎo)物。,第三節(jié) 培養(yǎng)基的種類與選擇,一 培養(yǎng)基的種類 1 按培養(yǎng)基的組成分為合成培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基：由已知組成成分的各種營養(yǎng)物質(zhì)組合的培養(yǎng)基； 復(fù)合培養(yǎng)基：由一些組成成分不完全明確的天然產(chǎn)物和一些無機(jī)鹽組成的培養(yǎng)基。,2 按形態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基； 3 按用途可分為孢子培養(yǎng)基、種子

7、培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。 (一)孢子培養(yǎng)基 一般要求： (1)基質(zhì)濃度(特別是氮源)要低些； (2)無機(jī)鹽的濃度適量。 常用孢子培養(yǎng)基： 麩皮、大(小)米、瓊脂培養(yǎng)基。,(二)種子培養(yǎng)基 一般要求： (1)營養(yǎng)成分易被吸收，豐富與完整，其中維生素與氮源略高； (2)與發(fā)酵培養(yǎng)基有內(nèi)在聯(lián)系。 成分： 葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米漿、酵母粉、硫酸銨、尿素、硫酸鎂、磷酸鹽等。,(三)發(fā)酵培養(yǎng)基 組成完整豐富，濃度與粘度適中；原材料質(zhì)量穩(wěn)定，且不影響產(chǎn)品分離精制。 二 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì) 滿足元素與能量要求。 考慮因素： 1 細(xì)胞的元素組成狀況(表3 -7)； 2 微生物對生長因子的需求； 3 營養(yǎng)成分與代謝產(chǎn)物

8、的內(nèi)在聯(lián)系； 4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。,三 培養(yǎng)基的篩選 單因子法。,第四節(jié) 影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素,一 原材料質(zhì)量的影響 1 有機(jī)氮源影響最大(黃豆餅粉、玉米漿、蛋白胨)； 2 碳源的純度； 3 油脂的質(zhì)量； 4 無機(jī)鹽和前體物的質(zhì)量。,二 水質(zhì)的影響 水中所含無機(jī)離子與有機(jī)物的含量。 三 滅菌的影響 滅菌對營養(yǎng)成分有破壞作用。 (1)葡萄糖的破壞：與氨基酸反應(yīng)、與磷酸鹽反應(yīng)； (2)無機(jī)鹽之間的反應(yīng)； (3)泡沫影響滅菌效果。,四 pH的影響 pH值偏高或偏低會加速培養(yǎng)基成分的分解； 控制pH以生理酸性或生理堿性物質(zhì)為主，以酸堿為輔； 培養(yǎng)基對pH有緩沖作用。 五 其他影響因素 粘度； 氧化還原電位；

9、 投錯料、計(jì)算錯誤等。,第五節(jié) 單糖制備,淀粉糖的制備,一、淀粉的組成及其特性,1 淀粉的組成,淀粉的組成,（1）直鏈淀粉 （2）支鏈淀粉 （3）聚合度,2 淀粉的特性,（1）糊化淀粉在熱水中能吸收水分而膨脹，最后淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成帶有粘性的淀粉糊，這一過程稱為糊化。 （2）淀粉與碘作用，產(chǎn)生鮮明的藍(lán)色“淀粉碘”復(fù)合物。,二 淀粉水解糖的制備方法,1 酸解法,是以酸（無機(jī)酸或有機(jī)酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解轉(zhuǎn)化葡萄糖的方法。,酸解法,優(yōu)點(diǎn)： 設(shè)備要求簡單，由淀粉逐步水解為葡萄糖的整個化學(xué)反應(yīng)過程僅在一個高壓容器進(jìn)行； 水解時間短，在0.3Mpa左右壓力下僅需5 20 m

10、in。,酸解法,缺點(diǎn)： （1）要求耐腐蝕、耐高溫、耐高壓的設(shè)備； （2）除了淀粉的水解反應(yīng)外，尚有副反應(yīng)，將造成淀粉轉(zhuǎn)化率降低； （3）葡萄糖液色素深，質(zhì)量差； （4）對淀粉原料要求嚴(yán)格，淀粉顆粒不宜過大且要均勻； （5）淀粉乳濃度不宜過高。,2 酶解法,酶解法是用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖。酶解法制葡萄糖可分為二步：第一步是利用淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)化為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個過程稱為“液化”。第二步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程，在生產(chǎn)上稱為“糖化”。淀粉的“液化”和“糖化”都是在微生物酶的作用下進(jìn)行，故也稱為雙酶水解法。,酶解法,優(yōu)點(diǎn)： （1）反應(yīng)條件溫

11、和，不需耐高溫、耐高壓、耐腐蝕的設(shè)備； （2）葡萄糖液顏色淺，質(zhì)量好； （3）酶作用的專一性強(qiáng)，淀粉的水解副反應(yīng)少，淀粉的轉(zhuǎn)化率高； （4）對淀粉要求不高，可用粗原料； （5）可在較高淀粉乳濃度下水解。,酶解法,缺點(diǎn)： （1）酶解反應(yīng)時間較長； （2）要求的設(shè)備較多。,3 酸酶結(jié)合法,（1）酸酶法 （2）酶酸法,三 水解糖液的質(zhì)量指標(biāo),1 色澤：淺黃、杏黃色，透明液 2 糊精：無 3 還原糖含量：2432%（根據(jù)生產(chǎn)需求） 4 透光率：85%以上 5 DE值： 96%以上,四 淀粉酸水解機(jī)理,淀粉酸水解機(jī)理,（1）淀粉水解過程的變化 淀粉 糊精 低聚糖 葡萄糖 碘顯色： 藍(lán)色暗紫紫紅褐暗紅紅淺

12、紅 糊精不溶于乙醇,淀粉酸水解機(jī)理,（2）葡萄糖對淀粉的理論轉(zhuǎn)化率 （C6H10O5）n + n H2O = n（C6H12O6） 162.14 18.02 180.16 淀粉產(chǎn)生葡萄糖的理論轉(zhuǎn)化率為：,淀粉酸水解機(jī)理,（3）DE值 DE值即葡萄糖值，用以表示淀粉水解程度及糖化程度，指的是葡萄糖占干物質(zhì)的百分率，即：,淀粉酸水解機(jī)理,2 葡萄糖的復(fù)合反應(yīng) 復(fù)合反應(yīng)是有害的，它降低葡萄糖的收率，影響葡萄糖的結(jié)晶。 淀粉乳濃度高，水解所得的葡萄糖濃度也高，致使復(fù)合反應(yīng)進(jìn)行強(qiáng)烈。,淀粉酸水解機(jī)理,3 葡萄糖的分解反應(yīng) 5羥甲基糠醛和有色物質(zhì)的生成量隨葡萄糖的濃度增加而增加，隨反應(yīng)時間的延長而增加。,

13、五 淀粉制糖工藝,1 雙酶法 （1）工藝流程 淀粉 調(diào)漿 調(diào)PH值加淀粉酶噴射液化 液化維持 滅液化酶 降溫 調(diào)PH值 加糖化酶 糖化滅糖化酶降溫調(diào)PH值 降溫加活性炭、助濾劑脫色壓濾 葡萄糖液,（2）工藝參數(shù),A） 調(diào)漿：1018Be， B） 液化： 淀粉酶量 510單位/克干淀粉， 液化PH值PH6.06.4， 液化溫度 90110， 液化維持時間 4590min， C） 滅液化酶：滅酶溫度 115120， 滅酶維持時間 510 min,工藝參數(shù),D）糖化： 糖化酶量80100單位/克干淀粉， 糖化PH值PH4.44.6， 糖化溫度 5560， 糖化時間 1640h， E）滅糖化酶： 滅酶

14、溫度 85左右， 滅酶維持時間 510 min,工藝參數(shù),F） 脫色： 脫色PH值PH 4.8， 脫色溫度4560， 脫色時間48h。,（3）糖化過程中DE值的變化,（4）節(jié)能設(shè)施在雙酶法中的應(yīng)用,（5）雙酶法的設(shè)備,調(diào)漿罐、液化噴射器、 液化維持罐、換熱器、 糖化罐、脫色罐、 壓濾機(jī)、貯糖罐、 物料泵、冷卻塔、水泵,2 酸法,（1）工藝流程 淀粉 調(diào)漿 加酸 升溫 維持 冷卻 中和 脫色 壓濾 葡萄糖液,（2） 工藝參數(shù),A） 調(diào)漿：1012 Be B） 水解：PH1.5 壓力0.28Mpa 溫度135140 時間1520min C) 中和： PH4.8 D) 脫色： 時間 48,糖蜜原料處

15、理,一、糖蜜原料的分類 生物發(fā)酵工業(yè)所用的糖蜜，主要是指制糖工業(yè)上的廢糖蜜(waste molasses)，它是甘蔗糖廠或甜菜糖廠的一種副產(chǎn)品。糖蜜是一非結(jié)晶糖分，本身含有相當(dāng)數(shù)量的發(fā)酵性糖 根據(jù)來源不同，糖蜜分為甘蔗糖蜜(cane molasses)、甜菜糖蜜(beet molasses)和高級糖蜜(high test molasses)等,二、糖蜜原料的性質(zhì)和組成 糖蜜的外觀是一種黏稠、黑褐色、呈半流動狀的物體，pH值5.5左右，相對密度1.43。 各種糖蜜中的糖類的組成也不相同。除含有發(fā)酵性的糖分外，還含有膠體物質(zhì)(為植物細(xì)胞壁上的多糖，要求少于0.008%，影響酵母生長和色澤 )、灰分

16、(Ca2+、Mg2+等)、,揮發(fā)性有機(jī)酸(甲酸、醋酸、丁酸、丙酸等，不能超過0.3% )、有機(jī)酸(具有危害的是亞硫酸，不能超過.%二氧化硫 )、微生物。 甘蔗糖蜜中的生物素較甜菜糖蜜中高。,三 糖蜜處理的目的與原理,目的： 1 蔗糖水解 蔗糖是由一分子果糖與一分子葡萄糖構(gòu)成的雙糖，水解后為果糖和葡萄糖。 2 除雜質(zhì) 主要是膠體、灰份等。,原理： 加酸 雙糖轉(zhuǎn)化成單糖 ； 硫酸、磷酸和石灰乳作用產(chǎn)生硫酸鈣沉淀 ； 釋出揮發(fā)酸，可在沸騰和通風(fēng)時驅(qū)除掉； 膠體絮凝。,加熱 蛋白變性沉淀，促進(jìn)膠體絮凝； 殺滅微生物。 通氣 有害氣體氧化驅(qū)除，如一氧化氮、二氧化硫、硫化氫等 ； 驅(qū)除揮發(fā)酸。,糖蜜處理的

17、質(zhì)量要求： 鈣的含量 0.02% 膠體含量 0.1% 發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化率85% 發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式為：,處理后還原糖總量處理前還原糖總量 糖蜜中發(fā)酵糖的轉(zhuǎn)化率=- 處理前總糖量處理前還原糖總量,測定方法： 還原糖 滴定； 膠體 酒精沉淀干燥法； 灰份 灼燒,六 糖蜜處理,1 處理量計(jì)算 根據(jù)培養(yǎng)基的消耗計(jì)算糖的需求量，再根據(jù)糖蜜中糖的含量折算，并做適度放大。,2一次處理法 （1）糖蜜加水稀釋至1517 oBx。 （2）加0.5%（按糖蜜重量計(jì)）工業(yè)用濃硫酸和0.5%磷酸（磷酸按45%計(jì)）（調(diào)pH在2.0至3.0之間）。 （3）加熱煮沸 （4）通風(fēng)0.51小時，使溫度降到90左右。 （5）加石灰乳使pH至4.85.1，澄清1624小時（若沉淀不完全，可用離心去除）。,3、二次處理法（適于含雜質(zhì)較多的糖蜜） （1）糖蜜加水稀釋至1517 oBx。 （2）加0.5%（按糖蜜重量計(jì)）工業(yè)用濃硫酸和0。5%磷酸（磷酸按45%計(jì)），澄清1624小時。清液加熱通風(fēng)后，加石灰乳使pH至4.8-5.1，再澄清1624小時備用。,第六節(jié) 培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌,一 培養(yǎng)基滅菌溫度