1、Western blot 實驗技術(shù),定義：,印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。 Western Blot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。 1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。 而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法,We

2、stern Blot基本原理,Western Blot：采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物 是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。 經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。,Western Blot一般流程,蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜 封閉 一抗雜交 洗滌 二抗雜交 洗滌 底物顯色,通過有

3、機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白 水溶液提取法 針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液 對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。 細(xì)胞裂解液： 0.5ml水+0.5ml裂解液+10l蛋白酶抑制劑+ 10l 泛酸鈉+ 1l pepstain 有機(jī)溶劑提取法 對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 通過層析或電洗脫法制備目的蛋白,蛋白樣品的制備,細(xì)胞數(shù)量達(dá)5106個時就可以做WB。 將細(xì)胞裂解液再離心，收集上清液 測蛋白濃度（Bca法）,統(tǒng)一上樣量 加loading BUFFER 煮樣5min-10min,蛋白樣品制備的注意事項：

4、,煮沸5-15min，以充分變性蛋白，保證蛋白從空間結(jié)構(gòu)變?yōu)橐患壗Y(jié)構(gòu)（多聚體解散為單聚體，氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為還原狀態(tài)等）。有的也可以在700C加熱5-10min，尤其適用于多次跨膜蛋白的檢測（這些蛋白在煮沸狀態(tài)下容易聚集，而聚集狀態(tài)則會影響標(biāo)本進(jìn)入凝膠的效率。）,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,原理： SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水 性的長碳鏈.當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺 基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋 白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合后,由于 SDS

5、 帶強(qiáng)負(fù)價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且 每單位重量的蛋白質(zhì)帶電價一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素,純凈水（ddH2O） 丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 （Arc-Bis） SDS Tris-HCL 四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合） 過硫酸銨(APS)（提供引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合的自由基）,凝膠成份,常用凝膠配置比例,凝膠濃度與蛋白分離范圍,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項：,做膠：防止漏膠、進(jìn)氣泡以及花膠(水封、插梳子和拔梳子)。 加樣：加樣量一樣，加樣時間要盡量短，以免樣

6、品擴(kuò)散 電泳：將膠夾好放于電泳槽中，加電泳buffer，將電壓調(diào)到90V開始電泳，待樣品在積層膠里壓成一條直線之后，將電壓調(diào)到120V，直到溴酚蘭前沿跑出膠后停止電泳。,膜的選擇,轉(zhuǎn)膜,半干法（用恒流） 將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕 潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)1030min。 濕法 將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝 置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)1h或過夜。,轉(zhuǎn)膜注意事項（一）,泡膜： 轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min （1.凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡） 轉(zhuǎn)

7、膜順序： 陰極碳板(黑)+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板（白） 轉(zhuǎn)膜條件： 0.4A 250V 1h-90min 冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜 （具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短。）,轉(zhuǎn)膜的注意事項（二）,避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。 夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全。,封閉（1h）(封閉時間過短會導(dǎo)致背景過深 ),5脫脂奶粉封閉1h，置于搖床上。 封閉前，要用雙蒸水洗3-5min,剪膜,一抗、二抗孵育,把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料盒中，根據(jù)濾膜面積

8、以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液與濾膜溫育（抗體濃度過高會導(dǎo)致背景較深，過低會導(dǎo)致和抗原結(jié)合不充分，出現(xiàn)假陰性 ）。室溫不少于7小時，4 時過夜。（一般） 回收一抗溶液，用TBST洗膜3次，每次5min（洗滌不充分會導(dǎo)致膜上非特異性條帶處仍有一抗殘留，會影響二抗結(jié)合的位置不準(zhǔn)確 ）。 加入二抗溶液，搖床上緩慢搖動， 室溫避光1.5-2h 回收二抗，TBST洗膜3次，每次5min，純凈水洗膜5min。 短時間多次洗膜較長時間少次洗膜更有效。,Tween有助于去除非特異性的結(jié)合，減少背景。,顯色反應(yīng),一般用ECL發(fā)光法 辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記二抗，用底物發(fā)光法：將兩種顯色底物1：1等體積混合

9、后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用X膠片把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面（時間根據(jù)光的亮度來衡量），顯影、定影。 注意：發(fā)光法檢測的時候曝光時間要恰到好處，過短會導(dǎo)致曝光不徹底， 影響條帶亮度，過長會導(dǎo)致熒光信號衰弱，也會使背景顏色加深。,抗體保存注意事項：,1.收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進(jìn)行分裝和保存！ 2.對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在 -200C。 2.1 分裝的量以一次實驗用完為好，最少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。 2.2 復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在40C，避免再凍起來！

10、3.大部分抗體收到后40C短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。 任何時候，絕對避免反復(fù)凍融！,Western Blot常見問題分析,SDS-PAGE電泳,膠不平？ 凝膠漏液？,膠板洗刷干凈 加入APS和TEMED的量要合適 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻 兩塊玻璃板底部要對齊,條帶比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”條帶？,凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩 拔梳子要迅速，且豎直的拔 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度 膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適,轉(zhuǎn)膜及抗