1、【成骨培養(yǎng)基】OriCellTM間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基由優(yōu)化的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)成骨分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)劑和預(yù)選胎牛血清組成?；A(chǔ)培養(yǎng)基 175 mL胎牛血清 20 mL青霉素-鏈霉素 2 mL谷氨酰胺 2 mL抗壞血酸鹽 400 uL -甘油磷酸鹽 2 mL地塞米松 20 uL茜素紅S 10 mL一、完全培養(yǎng)基的制備1. 使用前，將符合MSC標(biāo)準(zhǔn)的胎牛血清于2-80溫度下隔夜解凍或完全解凍。輕輕旋轉(zhuǎn)瓶子，確保均勻。血清已熱滅活，解凍后即可使用。注:解凍血清中可能含有絮狀沉淀物。血清中這些物質(zhì)的存在不會(huì)改變產(chǎn)品的性能特征。不建議通過過濾血清來去除這些沉淀。因此，可能會(huì)導(dǎo)致一些血清

2、營養(yǎng)素的損失。2. 使用前約30分鐘，室溫解凍抗壞血酸鹽、-甘油磷酸鹽、青霉素-鏈霉素溶液、谷氨酰胺溶液。輕輕倒瓶幾次，確保均勻。3. 使用前約10分鐘，在室溫下解凍地塞米松。注:取下瓶蓋前，先低速離心，以保證全部內(nèi)容物的回收。4. 用70% v/v乙醇對(duì)試劑盒中每個(gè)組件的瓶/瓶外表面消毒，讓乙醇蒸發(fā)。5. 無菌打開層流罩內(nèi)的瓶子/小瓶。6. 轉(zhuǎn)移全部抗壞血酸，-甘油磷酸鹽，胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液、谷氨酰胺溶液進(jìn)入MSC成骨分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基。7. 用少量基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗每個(gè)小瓶/瓶。然后將漂洗液倒回基培養(yǎng)基瓶中。8. 轉(zhuǎn)移全部地塞米松量，向瓶中加入0.5 mL的培養(yǎng)基，用吸管混合，再將整個(gè)混

3、合物倒回基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓶中。9. 重復(fù)幾次步驟8。10. 輕輕旋轉(zhuǎn)全部補(bǔ)充(完全)的培養(yǎng)基，以確?；旌衔锞鶆颉，F(xiàn)在可以使用完整的培養(yǎng)基了。注:雖然本試劑盒中的每個(gè)組件都是無菌提供的，但強(qiáng)烈建議過濾完全培養(yǎng)基。二、組織培養(yǎng)血管明膠涂層1. 在培養(yǎng)皿中加入0.1%的明膠溶液，完全蓋住培養(yǎng)基。2. 旋轉(zhuǎn)，直到凝膠溶液均勻地覆蓋整個(gè)容器底部。在室溫下放置30分鐘。3. 將所有明膠溶液吸出，并在層流罩/生物安全柜內(nèi)打開的容器中放置不超過30分鐘，使殘留的明膠溶液蒸發(fā)。4. 待培養(yǎng)容器干燥后，將其密封。三、成骨（六孔板）1. 將OriCellTM MSCs在37的OriCellTM MSCs培養(yǎng)基中，5% C

4、O2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2. 當(dāng)細(xì)胞約80-90%融合時(shí)，可與0.25%胰蛋白酶- 0.04% EDTA分離。3. 將生長培養(yǎng)基中的MSC以2104細(xì)胞/cm2的密度重新播種在預(yù)涂0.1%明膠溶液的6孔板中。4. 在37、5%的CO2加濕培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞。5. 當(dāng)細(xì)胞融合約60-70%時(shí)，小心地吸取生長培養(yǎng)基，加入2 mL OriCellTM間充質(zhì)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基。6. 用新鮮的OriCellTM間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基（37預(yù)熱）每3天換液一次，持續(xù)2-4周。7. 分化2-4周后，細(xì)胞固定，用茜素紅S染色。注:為防止成骨細(xì)胞脫離，建議分析前每2天更換半份培養(yǎng)基。四、茜素紅S染色分析1. 細(xì)胞分化完成后，取出成骨分化培養(yǎng)基，用1x磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗。用2 mL 4%甲醛溶液固定細(xì)胞30分鐘。2. 用1x PBS沖洗兩次。用1ml茜素紅S液對(duì)細(xì)胞染色3-5分鐘。3. 用1x PBS沖洗2-3次。4. 細(xì)胞現(xiàn)在可以在顯微鏡下觀察和分析。五、穩(wěn)定和儲(chǔ)存所有產(chǎn)品應(yīng)存放在暗處。MSC成骨分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基和茜素紅S在2-8穩(wěn)定1年，其他在