1、病毒TCID50測定（組織半數(shù)感染量）操作步驟(1) 準備細胞 取出一塊細胞培養(yǎng)板，每個孔大約傳800010000個細胞（一個T25瓶的細胞消化后加10ml培養(yǎng)液正好傳一塊96孔板，要傳勻）。每個孔的細胞鋪成單層大約60豐度即可接種病毒（下午傳好板第二天早上就能用）。細胞對照選取16個孔即可。滴定與對照可以在一塊培養(yǎng)板上進行，操作中注意不要竄孔。也可以分別在不同的細胞培養(yǎng)板上進行，但要保證實驗條件一致。(2) 稀釋待測病毒液。A法為參考書上標準的操作方法B法參照書將液體量減少后的結果病毒稀釋液根據(jù)是否需要胰酶來選擇適合的液體，無論哪種都無血清。A向每支試管中加入1.8ml病毒稀釋液。向1號試管

2、中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀釋至適宜濃度，最后一支試管。B在EP管中用無血清的孵育液10倍倍比稀釋病毒原液(10-1，10-210-10等)，根據(jù)病毒大致的滴度確定稀釋的倍數(shù)。首次滴定可以多稀釋幾個滴度。根據(jù)接種的孔數(shù)稀釋病毒，常規(guī)每個稀釋度接種4孔，則每個稀釋度配500l，即10-1為50l加入450l的孵育液中；如每個稀釋度接種8個孔，則各配制1ml，即10-1為100l加入900l孵育液中。若接種8個孔，則相應增加液體量。上述的配液并不是固定不變的，可以根據(jù)接種的量自行調整?！?！此步操作注意事項：1）建議每個稀釋度接種8個孔，若要統(tǒng)計分析則還要增加至16個孔。2）病毒稀釋過程中

3、一定將病毒液與孵育液充分混勻。2）此過程中需要使用加樣器和tip頭。使用前用75%乙醇擦拭加樣器，并用紫外線照射20min，確保無菌。使用新高壓的tip頭，外包裝一定在超凈臺（或安全柜中打開）?！?3) 接種取細胞培養(yǎng)板，用多道加樣器（又稱排槍）吸去96孔板中的培養(yǎng)液，吸取孵育液加在每孔中再輕輕吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因為血清能干擾病毒的吸附）。將稀釋好的病毒液加到96孔板上，每孔100l，根據(jù)觀察的習慣，一般從右到左，從上到下，從高稀釋度到低稀釋度（10-1，10-2 ）到原液加樣?！厩杏洠涸O置正常的細胞對照。每次實驗要重復4次，計算標準差。】37CO2培養(yǎng)箱中孵育1h

4、，取出培養(yǎng)板吸去病毒液（從低濃度向高濃度吸取可避免竄孔），加入維持液200l繼續(xù)在37 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4) 培養(yǎng)將培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)溫度 ，培養(yǎng) 天。(5) 測定結果取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細胞病變。計算方法 1) Spearman-Karber 法 LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + dR1/N1） X0 = 全部病變最低稀釋度對數(shù) d = 稀釋因數(shù)對數(shù) N1 = 每個稀釋度所種的孔數(shù) R1 = 病變孔數(shù) = 積和 LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.72) Reed-Muench法觀察CPE, 找出能引起半數(shù)細胞瓶或管感染的病毒稀釋倍數(shù)，按計算出該病毒液的TCID50由表看出，能使50%細胞管出現(xiàn)病變的病毒稀釋度在10-410-5之間，其中間距離比例按Reed和Muench公式計算：TCID50高于50%病變的病毒最高稀釋度的對數(shù)距離比例故能使50%細胞管發(fā)生病變的病毒稀釋度為10-4.5，即TCID50為104.5倍，當病毒懸液做104.5倍稀釋時，0.1ml中含1個TCID50