1、常用分子生物學(xué)技術(shù)的 原理及應(yīng)用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application,第 二 十 章,第 一 節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization & Blotting Technology,分子雜交技術(shù)的原理主要涉及 分子雜交特性（見第二章） 印跡技術(shù) 探針技術(shù),核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 利用DNA變性與復(fù)性這一基本性質(zhì)來進(jìn)行DNA或RNA定性或定量分析的一種技術(shù)。,一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理,第 二 節(jié),聚 合 酶 鏈 反

2、 應(yīng)Polymerase Chain Reaction（PCR）,一種可以將目的微量的DNA片斷擴(kuò)增100萬倍以上的技術(shù),PCR是一種模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。 根據(jù)DNA變性、復(fù)性的特點(diǎn)設(shè)計(jì)。,1993年諾貝爾 化學(xué)獎(jiǎng)獲得者,Kary Mullis,1985年由 穆里斯 首創(chuàng)。,可將微量的目的DNA片斷的數(shù)量擴(kuò)增100萬倍以上。,PCR擴(kuò)增目的基因,最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò) 耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀,各種PCR儀,PCR體系基本組

3、成成分,含Mg2+的緩沖液,dNTP,耐熱DNA聚合酶 Tag DNA聚合酶,特異性引物 一對(duì)分別與待擴(kuò)增DNA序列5端相同，3端互補(bǔ)的寡核苷酸片段。,模板DNA,模板DNA,引物,Taq DNA聚合酶,dNTP,含Mg2+緩沖液,PCR三步曲,變性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,循環(huán) 2530 次,使模板DNA完全變性成單鏈。同時(shí)引物自身和引物之間存在的局部雙鏈得以消除,使引物和模板DNA退火結(jié)合,此溫度下DNA聚合酶以dNTP 為底物催化DNA鏈的延長(zhǎng),三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)， 每次循環(huán)產(chǎn)物作為下一輪模板進(jìn)入下一輪循環(huán),第一輪循環(huán),引物A,引物B,變性（95）,退火（60）,延伸（7

4、2）,DNA-Pol,DNA-Pol,溫度,第二輪循環(huán),引物A,引物B,變性（95）,退火（60）,延伸（72）,溫度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第三次循環(huán),變性（95）,退火（60）,延伸（72）,溫度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第一次循環(huán),第二次循環(huán),第三次循環(huán),第四次循環(huán),PCR,二、PCR的主要用途,PCR的 用途,基因突變 分析,基因的 體外突變,目的基因 的克隆,DNA 序列測(cè)定,DNA和RNA 的微量分析,1、與反轉(zhuǎn)錄結(jié)合，直接從組織細(xì)胞中的

5、mRNA 獲得目的基因； 2、利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得目的基因片段； 3、利用簡(jiǎn)并引物從cDNA 文庫或基因組文庫中獲得具有一定序列相似性的基因片段； 4、利用隨機(jī)引物從cDNA文庫中克隆基因。,利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的DNA的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。,PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)DNA的含量要求很低。理論上只要存在一分子的模板就可以獲得目的片段。 RNA需要反轉(zhuǎn)錄。,利用PCR結(jié)合其它技術(shù)，可以提高基因突變檢測(cè)的敏感性。,三、幾種重要的PCR衍生技術(shù),（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù) （二）原位PCR技術(shù) （三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù),第三節(jié),基因文庫 Gene Library,基因組DNA文庫 (genomic DNA library) cDNA文庫(cDNA library),基因文庫(gene library),是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。,一、基因組DNA文庫,基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。,用于構(gòu)建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。,基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩