1、PCR-SSCP 實(shí)驗(yàn)步驟一樣品制備1PCR 擴(kuò)增并檢測(cè)。根據(jù)不同的引物挑選適合的退火溫度進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用 2-2.5%的瓊脂糖膠跑水平電泳檢測(cè)，上樣量 3-5ul。PCR 產(chǎn)物為 10ng/nl 左右為最佳。2PCR 產(chǎn)物與變性 buffer 混合。在干凈的 PCR 管底部加入 5ulSSCP 上樣緩沖液（變性緩沖液，同分子克隆中的測(cè)序緩沖液），然后在緩沖液中央加入 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。按照經(jīng)驗(yàn)，擴(kuò)增效果在瓊脂糖膠上能看出比較亮的帶的樣品加 1ul，效果很好加 0.5ul，如果不太好就適當(dāng)增加1.5、2 或 3 不等，同時(shí)加大上樣緩沖液的量，比如加 3ul 的 PCR 產(chǎn)物，緩沖

2、液加到 8ul 變性效果更好。3PCR 產(chǎn)物變性。加好的樣品進(jìn)行離心，使樣品集中在管底。PCR 儀上 95變性 10 分鐘，立即取出 PCR 產(chǎn)物連同架子一同置于冰上靜置 5min，以免變性的產(chǎn)物復(fù)性。注：3 和 4 步可以在制 SSCP 膠第四步后，等膠凝的過程中進(jìn)行。二制膠1 裝板。在所要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的每一副玻璃板先用自來水沖洗，然后使用 ddH2O 沖洗，然后使用吸水紙將玻璃板擦拭干，然后再玻璃板上涂抹無水酒精，待 2-3min 酒精揮發(fā)。將玻璃板組裝好放入凝膠架子中，兩邊及底部固定好，兩玻璃板保持水平，然后將發(fā)條擰緊。（可用無水乙醇測(cè)試是否漏膠）。2配膠。甘油濃度 50%的幾種濃度大板膠（

3、10ml 下層膠，5ml 濃縮膠）配方（兩塊膠 1.0mm）：8%6%30%PAGE2.7ml1ml10TBE1ml0.5ml50%甘油1ml0.5mlddH2O5ml3ml甘油濃度 50%的幾種濃度小板膠（15ml 下層膠，10ml 濃縮膠）配方（兩塊膠 1.5mm）3灌膠。配好膠后攪勻，灌入裝好的玻璃板中，注意不能產(chǎn)生氣泡，如果產(chǎn)生氣泡把板立起，輕輕敲打可使氣泡升出膠面，膠面與凹板上沿大約差 0.5cm 時(shí)插上梳子，要保證梳子齒和液面接觸處沒有氣泡，一旦產(chǎn)生要拔出重插。4靜置。灌好的膠平放或與水平成一比較小的角度（10o 以下）靜置水平桌面上 30min 左右使之充分聚合。注：此時(shí)可以進(jìn)行

4、 PCR 樣品變性，即第一部分的 3、4 步。二上樣1.安板。PAGE 聚合好后要及時(shí)拔出梳子（時(shí)間耽擱長(zhǎng)后會(huì)使梳子很難拔出），拔梳子時(shí)要用力均勻以保持膠孔的整齊。用夾子把膠板固定在電泳槽上，凹槽的一面朝里，安板時(shí)首先使板的底邊一端先接觸電泳液，再緩慢地過度到另一端，以免產(chǎn)生大氣泡（產(chǎn)生大氣泡會(huì)使電泳條帶彎曲）。2預(yù)電泳。從底槽把一些電泳液 1TBE 吸到上槽，使液面高出玻璃板矮邊 1cm 以上，并確保上槽不漏液。打開電源，大槽電壓調(diào)到 140-150V，小槽 110-120V，預(yù)電泳 10min 左右。(0.1W/cm,10，1-3h)8%6%30%PAGE（4）4.05ml2 ml10TB

5、E1.5ml1m50%甘油1.5m1mddH2O7.5ml6mlAPS105ul70 ulTEMED12ul12ulTotal15ml10mlAPS70ul70ulTEMED12ul8ulTotal10ml5ml3點(diǎn)樣。用微量進(jìn)樣器把準(zhǔn)備好的樣品按順序加到膠孔中。由于邊緣效應(yīng)帶型不整齊，每塊板中最邊上的兩個(gè)孔最好不要點(diǎn)樣。4電泳。大槽電壓 140-150V，小槽 110-120V，溫度在 10-15，恒溫電泳 10 個(gè)小時(shí)以上。三染色1固定。把膠卸下，做好起始記號(hào)，放入 70%乙醇中在搖固定 15min。固定好后乙醇回收（可以重復(fù)使用 5 次左右），蒸餾水洗兩遍，每遍 3min 左右。若同時(shí)染

6、兩塊膠固定和洗脫都要適當(dāng)增加時(shí)間。2染色。染色液（200ml 染色液含 3.6%的 NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水 2ml）染色 30min，同時(shí)染兩塊膠要適當(dāng)增加時(shí)間，需 40min 左右。倒掉染色液，洗 3 遍，每遍 3min，同時(shí)染兩塊膠要適當(dāng)增加時(shí)間。3顯色。顯色液（200ml 顯色液包含 1%檸檬酸鈉 1ml，甲醛 100ul）至清晰。倒掉顯色液，加蒸餾洗脫 3 次停顯。(也可將凝膠浸在含 0.5ug/ml 溴化錠的 1TBE 緩沖液中染色 10min，在紫外燈下觀察)附錄1. 甘油濃度 50%的幾種濃度大板膠（10ml 下層膠，5ml 濃縮膠）配方（兩塊膠 1

7、.0mm）：2. 甘油濃度 50%的幾種濃度小板膠（15ml 下層膠，10ml 濃縮膠）配方（兩塊膠 1.5mm）8%6%30%PAGE2.7ml1ml10TBE1ml0.5ml50%甘油1ml0.5mlddH2O5ml3mlAPS70ul70ulTEMED12ul8ulTotal10ml5ml310TBE 的配方：108g Tris 堿、55g 硼酸、40ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)定容 1L4.變性 buffer 的配方98%去離子甲酰胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯青 FF、0.025%溴酚藍(lán)注意事項(xiàng)：重復(fù)性.影響 SSCP 重復(fù)性的主要因素

8、為電泳的電壓和溫度.這兩個(gè)條件保持不變， SSCP圖譜可保持良好的重復(fù)性.一般 SSCP 圖譜是二條單鏈 DNA 帶，但有時(shí)有的 DNA 片段 可能只呈現(xiàn)一條 SSDNA 帶，或者三條以上，這主要是由于兩條單鏈 DNA 之間存在相似的立體構(gòu)象.有時(shí)三條以上的 SSCP 圖譜是由于野型 DNA 片段和突變型 DNA 片段共同存在的結(jié)果.靶 DNA 序列長(zhǎng)度的影響在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) SSCP 對(duì)短鏈 DNA 或 RNA 的點(diǎn)突變檢出率要比長(zhǎng)鏈的高，這可能是由于長(zhǎng)鏈 DNA 和 RNA 分子中單個(gè)堿基的改變?cè)诰S持立體構(gòu)象中起的作用較小的緣故.而有人認(rèn)為在 DNA 鏈較短的(400bp 以下)情況下，DNA

9、 的長(zhǎng)度不會(huì)影響 SSCP 的效果.電泳電壓和溫度的影響:為了使單鏈 DNA 保持一定的穩(wěn)定立體構(gòu)象，SSCP 應(yīng)在較低溫 度下進(jìn)行(一般 4-15之間).在電泳過程中除環(huán)境溫度外，電壓過高也是引起溫度升高的主要原因，因此，在沒有冷卻裝置的電泳槽上進(jìn)行 SSCP 時(shí)，開始的 5min 應(yīng)用較 高的電壓(250V)，以后用 100V 左右電壓進(jìn)行電泳.這主要是由于開始的高電壓可以使不同立體構(gòu)象的單鏈 DNA 初步分離，而凝膠的溫度不會(huì)升高.隨后的低電壓電泳可以使 之進(jìn)一步分離.在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)8%6%30%PAGE4.05ml2 ml10TBE1.5ml1m50%甘油1.5m1mddH2O7.5ml6mlAPS105ul70 ulTEMED12ul12ulTotal15ml10ml條件確定電泳電壓.SSCP 的結(jié)果斷定:由于在 SSCP 分析中非變性 PAG 電泳不是根據(jù)單鏈 DNA 分子和帶電量的大小來分離的，而是以單鏈 DNA 片段空間構(gòu)象的立阻大小來實(shí)現(xiàn)分離的，因此，這種分離不能反映出分子量的大小.有時(shí)正常鏈與突變鏈的遷移率很接近，很難看出兩者之間的差別.因此一般要求電泳長(zhǎng)度在 16-18cm 以上，以檢測(cè)限為指標(biāo)來判定結(jié)果.檢測(cè)限是指突變 DNA 片段與正常 DNA 片段可分辨的電泳距離差的最小值.大于檢測(cè)限則判定鏈的遷移率有改變，說明該 DN