1、模式生物-大腸桿菌、酵母菌,張紅霞,大腸桿菌簡介,大腸桿菌（Escherichia coli），是相對簡單的單細(xì)胞原核生物，所有DNA、RNA 和蛋白質(zhì)合成的機(jī)器都包含在同一細(xì)胞器中，可以相對容易的培養(yǎng)和操作。,酵母菌簡介,酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔(dān)子菌綱（擔(dān)子酵母菌）、半知菌類（半知酵母菌），共由56個屬和500多個種組成。 如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達(dá)系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。,釀酒酵母（Sacharomy cescerevisiae）是第一種至少在一萬年前就能被人工培育的真菌，是

2、最簡單的真核生物，是由一個細(xì)胞組成的獨(dú)立的生物個體，能在基本培養(yǎng)基上生長，易于培養(yǎng)和操作，被稱為真核生物中的“大腸桿菌”。 早在1996年就完成了釀酒酵母的基因組測序，這是人類第一次獲得真核生物基因組的完整核苷酸序列，被稱為遺傳學(xué)研究上的一座里程碑。,大腸桿菌基因組,大腸桿菌通常只有一條染色體，比高等生物的基因組要小得多，并且具有較高的基因密度（大約每1 kb 就有一個基因），沒有內(nèi)含子和很少有重復(fù)DNA，易于尋找和分析基因.,通過對酵母全基因組序列測定，其基因組大小約為12 Mb，初步確定了5 885 個編碼蛋白質(zhì)的基因，140 個rRNA 基因、275 個tRNA 基因，第一次揭示了一種真

3、核生物的全部基因的數(shù)目和大體上的功能分類. 酵母基因組中有將近31編碼蛋白質(zhì)或者具有開放閱讀框，與哺乳動物編碼蛋白質(zhì)的基因有高度的同源性。,酵母菌基因組,酵母與其它真核生物相比，它們的基因組較?。s12 Mb），基因數(shù)目也比較少（約5 885）.與大腸桿菌類似，它們可以在實驗室里快速繁殖，在理想條件下，每次細(xì)胞分裂大約90 min，可以從單個細(xì)胞繁殖成克隆群體. 酵母作為模式實驗系統(tǒng)最重要的優(yōu)點(diǎn)是，酵母細(xì)胞不僅簡單，而且具有所有真核生物細(xì)胞的主要特征，如含有一個獨(dú)立的細(xì)胞核、多條線性染色體包裝成染色質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)包含了全部的細(xì)胞器（如線粒體）和具有細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)（如肌動纖維蛋白）等.,大腸桿菌遺傳學(xué)

4、研究應(yīng)用,大腸桿菌的生活周期很短，并且單個細(xì)胞可以很容易的獲得一個遺傳上同源的細(xì)胞群體（克?。? 細(xì)菌是單倍體，這意味著即使是隱性突變，也能夠表現(xiàn)出突變的表型，同時細(xì)菌之間可以方便地進(jìn)行遺傳物質(zhì)的交換，細(xì)菌的這些特征便于對其進(jìn)行遺傳學(xué)研究.,大腸桿菌作為生命科學(xué)研究的模式系統(tǒng)，其主要優(yōu)勢是具有遺傳交換系統(tǒng). 遺傳交換使定位突變、構(gòu)建含多種突變的菌株、構(gòu)建用來辨別顯性突變和隱性突變及進(jìn)行順反式分析的部分雙倍體的菌株成為可能. 這種遺傳交換系統(tǒng)主要通過兩種方式構(gòu)建的.,第一種方式是大腸桿菌通過性結(jié)合交換DNA，大腸桿菌的育性質(zhì)粒（F 因子，F(xiàn)-factor）具備把自身從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞的能

5、力. F 因子介導(dǎo)的結(jié)合是一個復(fù)制的過程，F(xiàn)+細(xì)胞轉(zhuǎn)移一個拷貝的F 因子給F-細(xì)胞. 有時，F(xiàn) 因子整合到染色體中，就會引起寄主染色體通過接合向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移. 含有整合的F 因子的菌株叫做Hfr 菌株（高頻重組菌株，Hfr strain），這種材料對于進(jìn)行遺傳交換研究非常有用。,第二種方式是通過噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，噬菌體成熟時有一部分噬菌體的DNA 被寄主DNA所取代，當(dāng)噬菌體感染下一個細(xì)胞時，從以前寄主那里獲得的染色體DNA 片段可以和被感染的寄主染色體發(fā)生重組，導(dǎo)致遺傳信息從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。,在酵母系統(tǒng)中，單倍體和雙倍體細(xì)胞的存在促進(jìn)了酵母的遺傳分析. 酵母在單倍體和二倍體的狀態(tài)下

6、均能生長，并能在實驗條件下較為方便地控制單倍體和二倍體之間的相互轉(zhuǎn)換，這種轉(zhuǎn)換是通過交配（單倍體到雙倍體）和孢子生成（雙倍體到單倍體）來實現(xiàn)的，這對其基因功能的研究十分有利. 例如，要想知道一個特定的基因是否是細(xì)胞生長所必需的，可以在單倍體里敲除這個基因，單倍體細(xì)胞只能承受非必需基因的敲除。,酵母菌遺傳學(xué)研究應(yīng)用,酵母中容易對其基因組做精確的人為突變，當(dāng)把末端與基因組的任何一個特定區(qū)域同源的線性DNA 引入到酵母細(xì)胞中，酵母基因組就會發(fā)生非常高的同源重組，導(dǎo)致目標(biāo)染色體序列被所用的目的染色體片段所取代. 如精確地刪除整個基因的編碼區(qū)、改變單個特定的密碼子，甚至改變啟動子中一個特定的堿基對，這使

7、得研究基因或其調(diào)控序列的功能等具體問題變得比較容易.,在20 世紀(jì)60 年代末，Hartwell、Hunt 和Nurse 便認(rèn)識到用遺傳學(xué)方法研究細(xì)胞周期的可能性. Hartwell 采用釀酒酵母細(xì)胞建立系統(tǒng)模型，經(jīng)過一系列試驗，分離出細(xì)胞周期基因發(fā)生突變的酵母細(xì)胞，相繼發(fā)現(xiàn)了一系列與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的CDC 基因（cell division cycle genes）。,一種被稱為“START”的基因?qū)刂聘鱾€細(xì)胞周期的最初階段具有決定性的作用. Nurse 在Hartwell 的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的一種關(guān)鍵物質(zhì)CDK（細(xì)胞周期蛋白依賴激酶），并證明CDK 是通過對其它蛋白質(zhì)的化學(xué)作用

8、（磷酸化作用） 來驅(qū)動細(xì)胞周期. 鑒于利用酵母分子遺傳學(xué)對細(xì)胞周期調(diào)控理論的巨大貢獻(xiàn)，Hunt、Hartwell 和Nurse 榮獲了21 世紀(jì)的首屆諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎.,細(xì)胞生命活動中的許多過程諸如酶催化代謝反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)的修飾與加工、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)等都表現(xiàn)為一種蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)間的相互作用. 傳統(tǒng)的免疫印跡、Western blot等方法很難滿足對蛋白質(zhì)分子之間相互作用這一動態(tài)過程的研究需要. 利用酵母轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)，F(xiàn)ields 和Song 于1989 年創(chuàng)立了一種非常簡便而有效的研究蛋白質(zhì)相互作用的方法酵母雙雜交系統(tǒng)。,酵母雙雜交系統(tǒng),最突出的特點(diǎn)是可以在酵母這種生長迅速且易操

9、作的體系中研究真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，而且還可通過cDNA文庫篩選直接找到與未知蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的基因。,近年來為了適應(yīng)更廣泛的用途，在原有酵母雙雜交系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展了大量的衍生系統(tǒng)，如蛋白質(zhì)三雜交系統(tǒng)、激酶三雜交系統(tǒng)、小配體三雜交系統(tǒng)、RNA 三雜交系統(tǒng)等類型. 此外，還出現(xiàn)了為研究膜蛋白的相互作用而改進(jìn)的SOS 富集系統(tǒng)（SOS recruitment system，SRS），在該系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)之間的相互作用被人為限制在酵母細(xì)胞膜上。,應(yīng)用,利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素,1982年，美國Ely LiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個上市的基因工程藥物。

10、 由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點(diǎn)，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。,大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征,大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢,大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征,大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢,藍(lán)白斑篩選,篩選原理,野生型大腸桿菌產(chǎn)生的-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。有色物質(zhì)可以使整個培養(yǎng)菌落產(chǎn)生顏色變化，而顏色變化是鑒定和篩

11、選的最直觀有效的方法。,工程菌及載體,基因工程菌為-半乳糖苷酶缺陷型菌株。這種宿主菌的染色體基因組中編碼-半乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的-半乳糖苷酶失去正常N段一個146個氨基酸的短肽（即肽鏈），從而不具有生物活性，即無法作用于X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。 用于藍(lán)白斑篩選的載體具有一段稱為lacz的基因，lacz中包括：一段-半乳糖苷酶的啟動子；編碼肽鏈的區(qū)段；一個多克隆位點(diǎn)(MCS)。,-互補(bǔ),缺陷株基因無法單獨(dú)編碼有活性的-半乳糖苷酶，但當(dāng)菌體中含有帶lacz的質(zhì)粒后，質(zhì)粒lacz基因編碼的肽鏈和菌株基因組表達(dá)的端缺陷的-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，具有與完整-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成

12、藍(lán)色物質(zhì)的能力，這種現(xiàn)象即-互補(bǔ)。,操作中，添加IPTG(異丙基硫代-半乳糖苷)以激活lacz中的-半乳糖苷酶的啟動子，在含有X-gal的固體平板培養(yǎng)基中菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。以上是攜帶空載體的菌株產(chǎn)生的表型。當(dāng)外源DNA（即目的片段）與含lacz的載體連接時，會插入進(jìn)MCS，使肽鏈讀碼框破壞，這種重組質(zhì)粒不再表達(dá)肽鏈，將它導(dǎo)入宿主缺陷菌株則無互補(bǔ)作用，不產(chǎn)生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色，培養(yǎng)表型即呈現(xiàn)白色菌落。,實驗中，通常藍(lán)白篩選是與抗性篩選一同使用的。含X-gal的平板培養(yǎng)基中同時含有一種或多種載體所攜帶抗性相對應(yīng)的抗生素，這樣，一次篩選可以判斷出：未轉(zhuǎn)化的菌不具有抗

13、性，不生長；轉(zhuǎn)化了空載體，即未重組質(zhì)粒的菌，長成藍(lán)色菌落；轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落。,酵母基因工程,利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對預(yù)防病毒感染具有重大的社會效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。,產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母,整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建,PARS2,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,Bgl II,pBSAG151,11 kb,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,his+的轉(zhuǎn)化子,重組分子,轉(zhuǎn)化his-的受體細(xì)胞,染色體DNA,重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導(dǎo)乙肝病毒的表面抗原多肽（HBsAg）表達(dá)，最終S蛋白的產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白總量的3%在大規(guī)模的生產(chǎn)過程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個240L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬份乙肝疫苗