1、福林-酚法測定蛋白質(zhì)的含量,實驗目的,學習測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法 熟練分光光度計，微量移液器的操作以及標準曲線的制作,實驗原理,第一步雙縮脲反應（蛋白質(zhì)與堿性銅試劑反應）,在堿性條件下蛋白質(zhì)的肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)-銅復合物,第二步與福林-酚試劑反應 在堿性條件下 ，這種被作用的蛋白質(zhì)上的酚類基團極不穩(wěn)定，很容易還原福林酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸，生成鎢藍和鉬藍的混合物，呈藍色。 可利用分光光度計測得650nm的OD值，濃度大小跟OD值成正比y=kx+b OD值是optical density（光密度）： 入射光強度與透射光強度之比值的常用對數(shù)值,實驗原理,分光光度計的原理,制作標準

2、曲線： (1）選擇標準蛋白溶液(牛血清白蛋白），配制一定濃度母液 配制標準溶液濃度梯度，測定對應的OD值 (3）根據(jù)濃度和OD值得回歸方程即標準曲線 利用excele軟件 如何制作？ 如何評估？,x1y1 x2y2 x3y3 . . . .Xnyn y=kx+b,實驗方法,實驗方法,實驗方法,以0號管為空白對照，在分光光度計上以波長650nm比色，讀取光密度 值（OD值），標準蛋白含量g （或者標準蛋白濃度）作為橫坐標，OD 值作為縱坐標，制作標準曲線寫出回歸方程，根據(jù)待測樣品OD值計算蛋 白質(zhì)含量。 注意事項： 及時做好標記 加入試劑后應立即混勻 測定所加入的蛋白質(zhì)量應在標準曲線范圍之內(nèi),分

3、光光度計的使用方法,設置波長 設置樣品池個數(shù) 調(diào)零 測定 開啟機器，調(diào)節(jié)所需的波長，設置樣品池個數(shù) 空白對照管調(diào)零（一定放在離自己最近的那個樣品池） 將待測樣品液放入比色皿（2/3高度），并將比色皿放入樣品池內(nèi)，蓋好蓋子，測光密度值（OD值），按上下鍵翻看其他樣品池的數(shù)據(jù) 測量完畢，一定把比色杯用自來水和蒸餾水重新洗凈，倒置于濾紙上晾干,比色皿有光面和毛面，勿用手觸摸光面，使用時光面對準光路。 裝液體時，需達到比色皿2/3左右；若液體不慎溢出，需用紙巾吸干，儀器如果沾有液體，請迅速擦干。,注意事項,微量移液器的使用,原理 微量移液器是根據(jù)“虎克定律”設計的，“在一定限度內(nèi)彈簧伸展的長度與彈力成

4、正比”：也就是微量加樣器吸入液體的容量與加樣器內(nèi)的彈簧拉伸長度成正比。 常見種類 0.510l 550l 10100l 20200l (讀數(shù)窗顯示20200, 每轉1檔1l) 1001000l(讀數(shù)窗顯示1001000, 每轉1檔為 5l),1：選擇量程 根據(jù)轉移液體的量，選擇正確量程的微量移液器 2：調(diào)節(jié)吸量體積： 將微量移液器調(diào)至所需體積，千萬不要將讀數(shù)的調(diào)節(jié)超出最大值和最小值；,操作步驟,3：吸量 用移液器的吸桿插上合適的吸頭，旋緊。 握緊微量移液器，用大拇指按至第一檔，將吸頭插入溶液中。 然后松開大拇指，慢慢釋放按鈕以吸取液體（否則液體進入吸嘴太快，導致液體倒吸入移液器內(nèi)部）；然后將微

5、量移液器移出液面。 釋放液體時，槍頭接觸在容器壁上，先慢慢按至第一檔，停留12秒后，再按至第二檔以排出所有液體。,操作步驟,4. 更換吸頭： 吸取不同的液體，一定要更換槍頭，防止試劑交叉污染，更換槍頭時，對著廢棄桶，輕輕按下卸載吸頭的彈射器，吸頭自然脫落在廢棄桶內(nèi)。 5. 微量移液器的放置： 實驗完畢后，將移液器調(diào)回到接近最大量程，使彈簧處于松弛狀態(tài)，放到或者懸掛在架子上。,操作步驟,1. 吸取不同的液體時，切記要更換吸頭， 2. 調(diào)節(jié)移液器時，動作要輕緩，千萬不要將讀數(shù)的調(diào)節(jié)超出最大值和最小值，否則會造成損壞。 3. 吸取液體時，動作要輕緩，防止液體隨著氣流進入移液器的上部； 4. 帶有殘余液體吸嘴的移液器不能平放。 5. 每次實驗完畢后將微量移液器調(diào)至接近最大刻度，使彈簧處于自然伸展狀態(tài)。 6. 必須定期讓專業(yè)人員