1、高效液相色譜法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC),20.1.1 高效液相色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展,高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于1967年面世，導致高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的產(chǎn)生。,薄殼型填料，柱效僅每米10003000塔板數(shù),510m球型和無定型微粒硅膠，每米56萬理論塔板數(shù),高度均勻甚至單分散13m硅膠基質(zhì)球形填料，達1530萬理論塔板/m。,新型分離模式和方法不斷增加,基本特點 1. 高效、高速、高靈敏度、高選擇性 2. 填料粒徑和流動相性質(zhì)影響色譜柱效

2、3局限性 操作條件 1. 流動相對分離選擇性的影響 2. 柱外效應 3. 操作壓力 適用范圍廣,20.1.2.高效液相色譜法的特點及與其他色譜法比較,1. 吸附色譜(adsorption Chromatography) 2. 分配色譜(partition Chromatography) 3. 離子交換色譜(ion-Exchange Chromatography) 4. 體積排阻色譜(size Exclusion Chromatography) 需要指出的是每種色譜方法通常存在一種起支配作用的主要保留機理，但可能還存在次要的其他機理。,20.1.3.高效液相色譜法分類和正反相色譜體系,根據(jù)固定相

3、和液體流動相相對極性的差別，有正相色譜和反相色譜兩種色譜體系或方法。 反相色譜和正相色譜主要區(qū)別是流動相和固定相的相對極性，最初形成于液液分配色譜，現(xiàn)已廣泛應用于其他各種色譜方法。,上述每種色譜類型均可進一步分為多個不同色譜方法。這些方法可用于分析分離，也可用于制備分離，各色譜方法在相關(guān)領(lǐng)域應用互相補充。,20.1.3.高效液相色譜法分類和正反相色譜體系,現(xiàn)代高效液相色譜使用310m柱填料，為達到適用的流動相流速，高壓泵需提供幾十MPa或數(shù)百大氣壓力的柱前壓。因而HPLC儀器比其他類型的色譜儀要復雜和昂貴。,20.2. 高效液相色譜儀,HPLC示意圖,20.2. 高效液相色譜儀,現(xiàn)代高效液相色

4、譜儀配備一或多個流動相儲液器，一般為玻璃瓶。每個儲瓶容積5002000mL。儲液瓶位置要高于泵體，以保持一定的輸液靜壓差，在泵啟動時易于讓殘留在溶劑和泵體中微量氣體通過放空閥排出。 儲器常裝有脫除溶劑中溶解的氧、氮等氣體裝置，這些溶解氣可能形成氣泡引起譜帶展寬，并干擾檢測器正常工作。溶劑脫氣主要有兩種方法，其一是攪拌下真空或超聲波脫氣；另一種是通入氦或氮等惰性氣體帶出溶解在溶劑中空氣。儲液器的溶劑導管入口處裝有過濾器，以進一步除去溶劑中灰塵或微粒殘渣，防止損壞泵、進樣閥或堵塞色譜柱。,20.2.1.流動相貯器和溶劑處理系統(tǒng),通用HPLC儀輸液泵系統(tǒng)的基本要求是：提供(50-500)105Pa的

5、柱前液壓；輸出無脈動恒定的液流；流速范圍0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系統(tǒng)組件耐腐蝕(密封性良好的不銹鋼或氟塑料)。高壓泵產(chǎn)生的液體高壓沒有爆炸危險，因為液體的壓縮性極小。最重要的是系統(tǒng)密封性能好。 目前常使用的有三種類型的輸液泵，即往復柱塞泵、氣動放大泵、螺旋注射泵，它們各有優(yōu)、缺點。 往復柱塞泵,20.2.2.高壓泵系統(tǒng),1.電機，2.往復凸輪，3.密封柱塞，4.吸排液單向閥，5.溶劑入口，6.脈動阻尼器,7.接色譜柱。,高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、

6、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術(shù)要求較嚴。,進樣閥,20.2.3.進樣系統(tǒng),六口旋轉(zhuǎn)進樣閥示意圖,色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長530cm，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備往內(nèi)徑較大，可達25mm 以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離的性

7、能不受影響。,20.2.4.高效液相色譜柱,1.色譜柱類型,按內(nèi)徑大小可大致分為常規(guī)分析柱、制備或半制備柱、小內(nèi)徑或微徑柱、毛細管柱四種類型。,20.2.4.高效液相色譜柱,2.保護柱,一般在分析柱前裝上較短的保護柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護較昂貴的分析柱，延長使用壽命。,3.柱恒溫器,對色譜柱嚴格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。,在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物

8、理或化學性質(zhì)有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等。,20.2.5.液相色譜檢測器,l. 光吸收檢測器：紫外吸收檢測器，光二極管陣列檢測器，紅外吸收檢測器 2. 熒光檢測器 3. 示差折光率檢測器 4. 蒸發(fā)光散射檢測器 5. 電化學檢測器,20.2.5.液相色譜檢測器,20.3.1. 高效液相色譜固定相 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O1081.O109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是鍵合固定相，可擴大應用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于

9、離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。,20.3.高效液相色譜固定相和流動相,由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是： 1.化學惰性，不與固定相和被分離組分發(fā)生化學反應，保證柱的穩(wěn)定性和分離的重現(xiàn)性。 2.適用的物理性質(zhì)，包括沸點較低，以便于分離組分和溶劑回收;低粘度，利于提高傳質(zhì)速率和分離速度、降低柱前壓;弱或無紫外吸收等，以降低UV檢測器本低響應，提高檢測靈敏度;對樣品具有適當

10、溶解能力等。 3.溶劑清洗和更換方便，毒性小、純度高、價廉等，便于操作和安全。,20.3.2. 液相色譜流動相,20.3.2. 液相色譜流動相,20.4.吸附色譜(Adsorption Chromatography),20.4.1.液固吸附色譜固定相,吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學反應等，因此，以硅膠用得最多。 在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最

11、廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。,當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓肿?。于是，在固定相表面發(fā)生競爭吸附:,20.4.2吸附色譜分離機理,研究最多、應用最廣泛的高效液相色譜類型。 可分為液-液色譜和化學鍵合相色譜。前者是早期主要分配色譜類型，以物理吸附涂漬固定液在多孔載體表面上為固定相；后者以鍵合相為固定相，即化學鍵合固定相至載體或基質(zhì)表面。 化學鍵合相色譜巳成為占絕對優(yōu)勢的分配色譜類型。,20.5.分配色譜(Partition Chromatog

12、raphy),液一液分配色譜法（LLPC） 在液-液色譜中，流動相和固定相都是液體，能適用于各種樣品類型的分離和分析（極性的和非極性的、水溶性和油溶性的、離子型的和非離子型的化合物）。 （1）分離原理 液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復雜組分。,（2）固定相 由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。 為了更好解決固定液在載體上流失問題

13、。產(chǎn)生了化學鍵合固定相。它是將各種不同有機基團通過化學反應鍵合到載體表面的一種方法。代替了固定液的機械涂漬，它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應用最廣泛的一種固定相。約有3/4以上的分離分析是在化學鍵合固定相上進行的。,（3 ）流動相 在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相與固定相盡可能不互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。如果采用流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用流動相的極性大于固定

14、相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。,此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應用范圍較廣。,20.6.離子交換色譜,離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應通式如下

15、： 陽離子交換：,陰離子交換：,20.6.1.離子交換平衡,體積排阻或排除色譜(Size-Exclusion Chromatography,SEC),亦稱為凝膠色譜或凝膠過濾色譜,是分析高分子化合物的色譜技術(shù)。SEC填料為微粒均勻網(wǎng)狀多孔凝膠材料。 比填料平均孔徑大的分子被排阻在孔外而無保留，被最先洗出;分子體積比孔徑小的分子完全滲透進入孔穴，最后洗出; 處于這兩者之間具中等大小體積分子滲透進入孔穴，由于滲透能力差異而顯示保留不同，產(chǎn)生分子分級，這取決于分子體積，在一定程度上亦與分子形狀有關(guān)。 因此，SEC分離是基于溶質(zhì)分子體積差異在凝膠固定相孔穴內(nèi)的排阻和滲透性大小。,20.7.體積排阻色譜,20.7.1.分離原理,凝膠色譜法原理,分離類型的選擇 1據(jù)相對分子質(zhì)量選擇 相對分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標準液相色譜類型（液固、液液、及離子交換色譜）最適合的相對分子質(zhì)量范圍是2002000。對于相對分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。 2根據(jù)溶解度選擇 清楚樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。如果樣品可溶于水屬則屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜